ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Kimya Sənayesi üçün Dupleks Qaynaqlı Boru, kimyəvi komponent, SPECC1L çatışmazlığı birləşdirilmiş oynaqların sabitliyinin artmasına və kranial sinir qabığı hüceyrələrinin azaldılmasına səbəb olur.

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Kimya Sənayesi üçün Dupleks Qaynaqlı Boru

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.paslanmayan poladdan tikişsiz borular, parlaq tavlanmış borular, tikişsiz qıvrılmış borular və s. sahəsində ixtisaslaşmış aparıcı istehsalçıdır.Müştərilərin işini asanlaşdırmaq üçün bizdə qaynaqlanmış borular və borular da var.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ən qabaqcıl istehsal və sınaq avadanlığına malikdir.Biz sizin tələbinizi tamamilə təmin edə bilərik.Standarta görə çox ciddi şəkildə bizim istehsal etdiyimiz borular həmişə düzgün OD və WT tolerantlığına malikdir.Tolerantlıq nəzarəti istehsal standartlarına ciddi şəkildə uyğundur.Məhsullarımız hər zaman müştərilərimizdən razıdır.Məhsullarımızı satın alan müştərilər daha çox qazanc yaratdı.
a) OD (xarici diametr): 3,18 mm-dən 101,6 mm-ə qədər
b) WT (Divar Qalınlığı): 0,5 mm - 20 mm
c) Uzunluq: Müştərinin tələbinə uyğun olaraq
d) Standartlar: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 və s
e) Proses Metodu: ERW, EFW və s

Hər slaydda üç məqalə göstərən slayderlər.Slaydlar arasında hərəkət etmək üçün geri və sonrakı düymələrdən və ya hər slaydda hərəkət etmək üçün sonundakı slayd nəzarətçi düymələrindən istifadə edin.
Kəllə sinir zirvəsi hüceyrələri (CNCC) embrion sinir qıvrımlarını kəsir və orta üz strukturlarının əksəriyyətini təşkil edən faringeal tağlara köçür.CNCC disfunksiyası ümumi anadangəlmə qüsur olan orofasiyal yarığın etiologiyasında mühüm rol oynayır.Heterozigot SPECC1L mutasiyaları atipik və sindromlu yarıqları olan xəstələrdə aşkar edilmişdir.Burada kanonik yapışan qovşaq (AJ) komponentlərinin, β-katenin və E-kaderinin mədəni SPECC1L yıxılan hüceyrələrində gücləndirilmiş boyanmasını bildiririk və elektron mikroqrafiklər AJ-nin apikal-bazal diffuziyasını göstərir.SPECC1L-nin kraniofasiyal morfogenezdə rolunu anlamaq üçün biz Specc1l çatışmazlığı olan siçan modelini yaratdıq.Homoziqot mutantlar embrion öldürücüdür və sinir borularının bağlanması və CNCC laminasiyası pozulur.AJ zülalının boyanması mutant sinir qıvrımlarında artır.Bu AJ qüsuru AJ-nin həllini tələb edən CNCC delaminasiyasındakı qüsurla uyğundur.Bundan əlavə, Specc11 mutantları PI3K-AKT siqnalını azaldıb və apoptozu artırıb.In vitro, vəhşi tip hüceyrələrdə PI3K-AKT siqnalının yüngül şəkildə inhibə edilməsi AJ dəyişikliklərinə səbəb olmaq üçün kifayət idi.Əhəmiyyətli olan odur ki, SPECC1L-nin yıxılması nəticəsində yaranan AJ dəyişiklikləri PI3K-AKT yolunun aktivləşdirilməsi ilə geri qaytarıla bilər.Birlikdə götürüldükdə, bu məlumatlar göstərir ki, PI3K-AKT siqnalının və AJ biologiyasının yeni tənzimləyicisi kimi SPECC1L sinir borularının bağlanması və CNCC təbəqələşməsi üçün tələb olunur.
Kəllə sinir təpəsinin hüceyrələri (CNCCs) dorsal neyroektodermaya lokallaşdırılır və epiteliya-mezenximal keçidi (EMT) əhatə edən bir proses vasitəsilə inkişaf etməkdə olan sinir qıvrımlarının neyroepiteliumundan ayrılır1,2,3.Premiqrasiya edən epitelial CNCC-lər hüceyrələrarası birləşmələri pozur və birinci və ikinci faringeal tağları dolduran və kraniofasiyal qığırdaqların əksəriyyətini təşkil edən köç edən mezenximal CNCC-lərə çevrilir.Beləliklə, CNCC funksiyasını tənzimləyən genlər, orofasiyal yarıqlar kimi kraniofasiyal anadangəlmə anomaliyaların etiologiyasında tez-tez pozulur, ən çox yalnız ABŞ-da 1/800 doğuşa təsir göstərir.Anadangəlmə qüsurlardan biri8.
CNCC-nin delaminasiyası siçanlarda embrion inkişafının 8,5-9,5 günü arasında ön sinir borusunun bağlanması ilə üst-üstə düşür.Bir sıra siçan orofasiyal yarıqla əlaqəli genlərin mutantları da Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 və Pdgfrα12 daxil olmaqla sinir borusu qüsurunun müəyyən formalarını nümayiş etdirirlər.Bununla belə, sinir borusunun bağlanması və CNCC təbəqələşməsi prosesləri müstəqil hesab edilə bilər, çünki Splotch mutant siçanı (Pax3) CNCC təbəqələşməsinə və ya miqrasiyasına heç bir təsir göstərmədən sinir borusunun bağlanmasında qüsurlar nümayiş etdirir 13,14.CNCC disseksiyası və sinir borusunun bağlanmasında qüsurları olan əlavə siçan modelləri bu iki prosesin ümumi molekulyar əsasını təsvir etməyə kömək edəcəkdir.
CNCC-nin neyroepitelial hüceyrələrdən təcrid edilməsi, digərləri arasında E-kaderin, β-katenin, α-E-katenin və aktin filamentləri ilə əlaqəli α-aktinin ehtiva edən zülal komplekslərindən ibarət olan yapışan birləşmələrin (AJ) əriməsini tələb edir. Sinir qıvrımlarında E-kaderinin həddindən artıq ifadəsi tədqiqatları CNCC delaminasiyasında azalma və ya gecikmə göstərdi.Əksinə, E-kaderinin yatırılması erkən təbəqələşmə ilə nəticələnir15,16.CNCC təbəqələşməsi zamanı EMT-yə vasitəçilik edən amillərin bir çoxu transkripsiya faktorları (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) və matris metalloproteinazaları (MMPs) kimi hüceyrədənkənar matris (ECM) remodeling zülallarıdır, lakin CNCC-lər birbaşa sitoskeletal AJdir. hələ məlum deyil.PI3K-AKT yolunun E-kaderin səviyyələrini, əsasən xərçəng araşdırmalarından antaqonizm etdiyi məlumdur17.Son tədqiqatlar göstərdi ki, siçanlarda PDGFα əsaslı PI3K-AKT siqnalının itirilməsi kraniofasiyal anormalliklərə, o cümlədən yarıq damaq və sinir borusu qüsurlarına gətirib çıxarır12.Bununla belə, PI3K-AKT yolu ilə CNCC təbəqələşməsi zamanı AJ sabitliyi arasındakı əlaqə aydın deyil.
Biz əvvəllər SPECC1L-ni ağızdan gözə qədər uzanan, oblique cleft (ObFC) və ya Tessier IV18 yarığı kimi tanınan ağır yarığı olan iki insanda ilk mutant gen kimi təyin etdik.SPECC1L mutasiyaları otozomal dominant Opitz G/BBB sindromu (OMIM #145410) olan iki çoxnəsilli ailədə müəyyən edilmişdir ki, burada təsirə məruz qalan şəxslərdə hiperməsafə və yarıq dodaq/damaq19 və Tibi həddindən artıq məsafə sindromu olan bir ailədə (OMIM #145420)20 .Opitz G/BBB sindromu hallarının yarısından çoxu X ilə bağlıdır (OMIM #300000) və mikrotubulla əlaqəli hüceyrə skeletinin 22-ci zülalını kodlayan MID1 genindəki mutasiyalar səbəb olur.Biz fərz edirik ki, SPECC1L, həmçinin mikrotubullar və aktin sitoskeleti ilə əlaqəli bir zülal, hüceyrənin yapışması və miqrasiyası 18 zamanı aktin sitoskeletinin yenidən qurulması üçün tələb olunan siqnala vasitəçilik edə bilər.In vitro və in vivo tədqiqatlar vasitəsilə biz indi SPECC1L-ni PI3K-AKT siqnalı vasitəsilə AJ sabitliyinin yeni tənzimləyicisi kimi təsvir edirik.Hüceyrə səviyyəsində SPECC1L çatışmazlığı pan-AKT zülalının səviyyəsinin azalması və AJ-nin apikal-bazal dispersiyasının artması ilə nəticələndi ki, bu da AKT yolunun kimyəvi aktivləşməsi ilə aradan qaldırıldı.In vivo, Specc11 çatışmazlığı olan embrionlarda sinir borusu bağlanması pozulur və CNCC disseksiyası azalır.Beləliklə, SPECC1L üz morfogenez zamanı normal CNCC funksiyası üçün tələb olunan yüksək tənzimlənən hüceyrə yapışmasına əsaslanan siqnalda işləyir.
Hüceyrə səviyyəsində SPECC1L-nin rolunu xarakterizə etmək üçün SPECC1L18-də çatışmazlığı olan daha əvvəl təsvir edilmiş sabit osteosarkoma hüceyrə xətti U2OS istifadə etdik.SPECC1L (kd) yıxılan bu stabil U2OS hüceyrələrində SPECC1L transkriptlərinin və zülallarının səviyyələrində orta dərəcədə (60-70%) azalma, aktin sitoskeletonunun miqrasiyasında və yenidən təşkilində qüsurlar var idi 18. Bunun əksinə olaraq, ciddi keçici azalma SPECC1L-nin mitotik qüsurlara səbəb olduğu göstərilmişdir 23 .Əlavə xarakteristikaya görə, sabit SPECC1L-kd hüceyrələrimizin morfologiyanı çox yüksək dərəcədə birləşmədə dəyişdiyini gördük (Şəkil 1).Fərdi nəzarət hüceyrələri və aşağı birləşmədəki kd hüceyrələri oxşar görünürdü (Şəkil 1A, D).Füzyondan 24 saat sonra nəzarət hüceyrələri kuboid formasını saxladı (Şəkil 1B, E), SPECC1L-kd hüceyrələri isə uzandı (Şəkil 1C, F).Hüceyrə şəklindəki bu dəyişikliyin miqyası nəzarət hüceyrələrinin və kd hüceyrələrinin in vivo canlı görüntüləri ilə ələ keçirildi (film 1).Birləşən hüceyrələrdə SPECC1L-nin rolunu müəyyən etmək üçün əvvəlcə onun ifadəsini araşdırdıq.SPECC1L zülal səviyyələrinin birləşmə zamanı artdığını (Şəkil 1G), SPECC1L transkript səviyyələrinin isə artmadığını gördük (Şəkil 1H).Bundan əlavə, hüceyrə sıxlığı artdıqca, SPECC1L zülalı hüceyrələrarası sərhədlərdə toplanır (Şəkil 2A-E), membranla əlaqəli β-katenin ilə üst-üstə düşən bir nümunə ilə (Şəkil 2A'-E').SPECC1L-nin aktin sitoskeleton 18,23 ilə əlaqəsini nəzərə alaraq, SPECC1L-nin aktin əsaslı yapışan birləşmələrlə (AJ) qarşılıqlı əlaqədə olduğunu fərz etdik.
(AF) SPECC1L yıxılan (DF) hüceyrələri nəzarət U2OS hüceyrələri (AC) ilə müqayisədə yüksək birləşmədə (F) uzanır.Burada müxtəlif hüceyrə sıxlığı üçün seçdiyimiz altı vaxt nöqtəsindən üçü (T1, T3, T6) göstərilir.(G) SPECC1L zülalının nəzarət hüceyrələrində aşağı səviyyəli birləşmə ilə müqayisədə yüksək birləşmə dərəcəsində sabitləşdiyini göstərən Western blot analizi.SPECC1L-in qərb ləkəsi gözlənilən 120 kDa diapazonunu və daha yüksək molekulyar çəki bandını göstərir, ola bilsin ki, tərcümədən sonra dəyişdirilmişdir (*).Western blot analizi aşağı və yüksək birləşmə üçün eyni şəraitdə aparılmışdır.SPECC1L-ni aşağı və yüksək birləşmədə göstərən şəkillər eyni ləkədən götürülüb.Eyni ləkə çıxarıldı və β-aktin antikoru ilə yenidən araşdırıldı.(H) Kəmiyyət RT-PCR analizi SPECC1L transkript səviyyələrində heç bir əhəmiyyətli dəyişiklik göstərmədi.Səhv çubuqları dörd müstəqil təcrübədən SEM-ləri təmsil edir.
(AE) SPECC1L yıxılması (kd) ilə U2OS hüceyrələrində hüceyrə forması analizini və AJ dəyişikliklərini normallaşdırmaq üçün bir sıra hüceyrə sıxlığını təmsil edən altı vaxt nöqtəsini (T1-T6) seçdik.Bu zaman nöqtələrinin ilk beşinə tək hüceyrələr (T1), kiçik hüceyrə klasterlərinin 50-70% birləşməsi (T2), kd hüceyrələrinin formasını dəyişmədən birləşmə (T3), kd hüceyrələrinin yenidən formalaşdırılması (T4) və 24 saatlıq dəyişikliklər daxildir.kd (T5) hüceyrələrinin posterior formasında.SPECC1L zülalı əsasən T1 (A)-da sitoplazmada səpələnmişdir, lakin onun yığılması sonrakı zaman nöqtələrində hüceyrələrarası sərhədlərdə müşahidə edilmişdir (B-E, oxlar).(FJ) β-katenin AJ kompleksi ilə əlaqəli hüceyrələrarası sərhədlərdə oxşar yığılma göstərir.(A'-E') SPECC1L və β-katenin yüksək hüceyrə sıxlığında hüceyrə sərhədlərində üst-üstə düşən boyanma göstərir (oxlar).(F'-J') SPECC1L-kd hüceyrələrində β-katenin boyanması aşağı hüceyrə sıxlığında (F'-H') normal görünür, lakin hüceyrə forması dəyişdikcə genişlənir (I', J'; oxlar), AJ olduğunu göstərir. dəyişiblər.Barlar = 10 µm.
Daha sonra SPECC1L çatışmazlığının AJ-yə təsirini müəyyən etməyə çalışdıq.F-aktin, miyozin IIb, β-katenin və E-kaderin24,25,26,27 kanonik komponentləri də daxil olmaqla bir neçə AJ ilə əlaqəli markerlərdən istifadə etdik.Aktin stress lifləri SPECC1L-kd hüceyrələrində daha əvvəl təsvir edildiyi kimi artmışdır (Şəkil 3A, B) 18.Aktin filamentləri ilə əlaqəli miyozin IIb in vitro SPECC1L-kd hüceyrələrində oxşar artım göstərdi (Şəkil 3C, D).AJ ilə əlaqəli β-katenin hüceyrə membranında kaderinə bağlanır və nəzarət kubositlərində normal "pətək" ifadə modelini göstərir (Şəkil 3E, G).Maraqlıdır ki, konfokal mikroskopiyadan istifadə edərək düz şəkillərdə birləşən SPECC1L çatışmazlığı olan hüceyrələrin hüceyrə membranında β-katenin (Şəkil 3E, F) və E-kaderin (Şəkil 3G, H) boyanması genişlənmiş boyanmanın görkəmli nümunələrini göstərdi.kd hüceyrələrində AJ ilə əlaqəli β-katenin boyanmasının bu genişlənməsi birləşmə zamanı ən çox ifadə edildi, lakin hüceyrə şəklində dəyişikliklərdən əvvəl göründü (Şəkil 2F-J, F'-J').Bu genişlənmiş AJ boyanmasının fiziki təbiətini müəyyən etmək üçün SPECC1L-kd U2OS hüceyrələrinin apikal-bazal səthindəki hüceyrə sərhədlərini ötürücü elektron mikroskopiyası (TEM) ilə araşdırdıq (Şəkil 3I,J).AJ (oxlar) göstəricisi olan ayrı-ayrı elektron sıx bölgələri olan nəzarət hüceyrələrindən (Şəkil 3I) fərqli olaraq, kd hüceyrələri (Şəkil 3J) apikobazal müstəvi boyunca AJ-nin yüksək elektron sıxlığının göstəricisi olan böyük, bitişik bölgələri göstərdi..Bundan əlavə, eninə kəsiklərdə kd hüceyrələrində geniş hüceyrə membranı kıvrımlarını müşahidə etdik (Şəkil S1A, B), bu, β-katenin və E-kaderin boyama zolaqlarının genişlənmiş modelini izah edir (Şəkil 3F, H).AJ-lərdə SPECC1L-nin rolunu dəstəkləmək üçün β-katenin birləşən U2OS hüceyrələrinin lizatlarında SPECC1L ilə birgə immunoprecipitasiya edilmişdir (Şəkil 3K).AJ markerləri üçün uzadılmış immun boyama ilə yanaşı, TEM analizi SPECC1L çatışmazlığının AJ apikal-bazal sıxlığını və dəyişkənliyini artırdığı fərziyyəmizə uyğun idi.
(AH) Qaynaşmadan 48 saat sonra kd hüceyrələrində F-aktin boyanmasının artması (T6; A, B).F-aktin (C, D) ilə əlaqəli miyozin IIb-nin dəyişdirilmiş boyanması.Nəzarət hüceyrələrində (E, G) β-katenin və E-kaderin membranının boyanmasının hamar nümunəsi SPECC1L-kd (F, H) hüceyrələrində gücləndirilmişdir.Barlar = 10 µm.(I–J) Apikal-bazal hüceyrələrarası birləşməni müşahidə edən elektron mikroqrafiklər.Nəzarət hüceyrələri yapışqan birləşmələri göstərən fərqli elektron sıx bölgələri göstərir (I, oxlar).Bunun əksinə olaraq, SPECC1L-kd hüceyrələrində bütün apikal-bazal qovşağın elektron sıxlığı (J, oxlar) göründü ki, bu da yapışqan birləşmələrin artan sıxlığını və dispersiyasını göstərir.(K) β-katenin birləşən U2OS hüceyrə lizatlarında SPECC1L ilə birgə immunoprecipitasiya edilmişdir.Dörd müstəqil təcrübədən birini təmsil edən bir nöqtədən çəkilmiş şəkil.
SPECC1L-nin kraniofasiyal morfogenezdəki rolunu başa düşmək üçün biz iki müstəqil ES tələ hüceyrə xəttindən, DTM096 və RRH048 (BayGenomics, CA) istifadə edərək Specc1l çatışmazlığı olan siçan modelini yaratdıq, hansılar intron 1-i təmsil edir və Specc1l transkriptləri Şəkil 115-də çəkilmişdir. .4A, şəkil S2).Aldatma vektor əlavəsinin genomik yeri bütün genom ardıcıllığı ilə müəyyən edildi və PCR ilə təsdiq edildi (Şəkil S2).Hər iki gen tələsi dizaynı, həmçinin tutulduqdan sonra Specc11-lacZ müxbirlərinin çərçivədə birləşməsinə imkan verdi.Buna görə, X-gal boyanması ilə təyin olunan lacZ ifadəsi Specc11 ifadəsinin göstəricisi kimi istifadə edilmişdir.Hər iki allel oxşar lacZ ifadə nümunələri göstərdi, intron 1-də DTM096 gen tələsi intron 15-də RRH048-dən daha güclü ifadə nümayiş etdirdi (göstərilmir).Bununla belə, Specc1l E8.5-də sinir qıvrımlarında (Şəkil 4B), E9.5 və E10.5-də sinir borusu və üz proseslərində (Şəkil 4C, D) və inkişaf edən əzalarda xüsusilə güclü ifadə ilə geniş şəkildə ifadə edilir. E10-da.5 və gözlər (Şəkil 4D).Daha əvvəl E10.5-də ilk faringeal qövsdə SPECC1L ifadəsinin CNCC nəslinə uyğun olaraq epiteldə və əsas mezenximada18 mövcud olduğunu bildirdik.CNCC-də SPECC1L ifadəsini sınamaq üçün E8.5 sinir qıvrımlarını (Şəkil 4E-J) və E9.5 kəllə hissələrini (Şəkil 4K-) yerinə yetirdik.E8.5-də SPECC1L NCC markerləri ilə boyanmış hüceyrələr də daxil olmaqla intensiv şəkildə (Şəkil 4E, H) sinir qatlarını ləkələdi (Şəkil 4G, J).E9.5-də, SPECC1L (Şəkil. 4K, N) AP2A (Şəkil. 4L, M) və ya SOX10 (Şəkil. 4O, P) ilə birlikdə boyanmış miqrasiya edən CNCC güclü şəkildə ləkələnmişdir.
(A) ES DTM096 (intron 1) və RRH048 (intron 15) hüceyrə klonlarında fırıldaq vektorunun daxil edilməsini göstərən siçan Specc11 geninin sxematik təsviri.(BD) E8.5-dən E10.5-ə qədər Specc1l ifadəsini təmsil edən heterozigot Specc1lDTM096 embrionlarının lacZ boyanması.NE = neyroektoderm, NF = sinir qatı, PA1 = birinci faringeal qövs.E8.5 (NF; EJ) sinir qıvrımlarında və E9.5 (KP) kəllə hissələrində NCC markerləri AP2A və SOX10 ilə (EP) SPECC1L immun boyama.SPECC1L boyanması AP2A (F, G; ox başlıqları) və SOX10 (I, J; ox başları) ilə etiketlənmiş hüceyrələr də daxil olmaqla E8.5 (E, H; ox başlıqları) sinir qıvrımlarında geniş şəkildə müşahidə edilmişdir.E9.5-də SPECC1L AP2A (L, M; oxlar) və SOX10 (O, P; oxlar) etiketli miqrasiya edən CNCC-ləri (K, N; oxlar) güclü şəkildə ləkələdi.
Heterozigot Specc1lDTM096/+ və Specc1lRRH048/+ siçanları arasında keçid iki gen tələsi allelinin tamamlayıcı olmadığını və hər iki gen tələsi alleli üçün mürəkkəb heterozigotların və embrion homoziqotların embrion öldürücü olduğunu göstərir (Cədvəl S1).Mendel nisbətləri doğum zamanı heterozigotların sağ qalma nisbətinin azaldığını göstərdi (gözlənilən 1,34-ə qarşı 2,0).Biz heterozigotlar arasında aşağı perinatal ölümü qeyd etdik, bəzilərində kraniofasiyal anomaliyalar var idi (Şəkil S3).Bununla belə, bu perinatal kraniofasiyal fenotiplərin aşağı nüfuzetmə qabiliyyəti onların əsas patofizyoloji mexanizmlərini öyrənməyi çətinləşdirir.Buna görə də, biz homozigot Specc11 mutantlarının embrion öldürücü fenotipinə diqqət yetirdik.
Əksər mürəkkəb heterozigot və ya homozigot Specc1lDTM096/RRH048 mutant embrionları E9.5-10.5-dən sonra inkişaf etməyib (Şəkil 5A-D) və sinir borusu anteriordan bağlanmayıb (Şəkil 5B, D) və bəzən arxadan bağlanıb (göstərilməyib) ..Bu kəllə sinir borusunun bağlanma qüsuru E10.5-də sinir qıvrımlarında qalan DLX2 ilə işarələnmiş CNCC-nin əksəriyyəti ilə əlaqəli idi, bu da heç bir parçalanma olmadığını göstərir (Şəkil 5A'-D').CNCC-nin ümumi ölçüsünün də azaldığını müəyyən etmək üçün biz Wnt1-Cre və ROSAMTmG ilə gen tələ xəttlərimizdə GFP ilə CNCC xətlərini etiketlədik.Biz bütün embrionlardan çeşidlənmiş GFP+ NCC və GFP- (RFP+) qeyri-NCC-ni yayımlayırıq.E9.5-də, axınla çeşidlənmiş GFP etiketli CNCC-lərin nisbəti WT və mutant embrionlar (göstərilmir) arasında əhəmiyyətli dərəcədə dəyişməyib, bu da normal CNCC spesifikasiyasını göstərir.Buna görə də biz fərz etdik ki, məruz qalmış sinir qıvrımlarında qalıq Wnt1-Cre və DLX2 boyanması (Şəkil 5B') SPECC1L-kd hüceyrələrində göründüyü kimi, ehtimal ki, AJ hüceyrələrinin artan sıxlığı və ya dispersiyasına görə qüsurlu CNCC təbəqələşməsi ilə bağlıdır.Sinir qatında CNCC varlığını təsdiqləmək üçün SOX10, AP2A və DLX2 NCC markerlərindən istifadə etdik (Şəkil 5E-R).E8.5-də WT (Şəkil 5E, G, I) və Specc1l mutantının (Şəkil 5F, H, J) bölmələrində bütün üç NCC markerləri üçün sinir qatının boyanması müşahidə edildi.E9.5-də, NCC markerləri WT bölmələrində (Şəkil. 5M, O, Q) miqrasiya edən NCC-ni ləkələyərkən, Specc1l mutant embrionlarının məruz qalmış sinir qatlarında qalıq NCC boyanması müşahidə edildi (Şəkil 5N, P, R).SOX10 və DLX2 köç edən CNCC-ləri qeyd etdiyinə görə, bu nəticə onu göstərir ki, SPECC1L çatışmazlığı olan CNCC-lər post-miqrasiya spesifikasiyasına nail olurlar, lakin sinir qıvrımlarından miqrasiya edə bilmirlər.
Specc11 çatışmazlığı qüsurlu sinir borusu bağlanmasına, kranial sinir qabığının hüceyrələrinin və AJ-lərin delaminasiyasına səbəb olur.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') ilə etiketlənmiş miqrasiya edən kəllə sinir uc hüceyrələrini (CNCC) daşıyan embrion.Əksinə, Specc11 mutant embrionları açıq sinir qıvrımlarını (B), ox ucları) və köç etməyən CNCC-ləri (B', ox başlıqları) göstərir.(C, D') E10.5 WT embrionlarının (C, C') və Specc1l (D, D') CNCC marker DLX2-nin parlaq sahə şəkilləri (C, D') və immuno-boyanması (C', D').WT E10.5 embrionlarında DLX2-müsbət CNCC gill tağlarını (C', oxlar) kolonizasiya edir, mutantlarda isə açıq sinir qıvrımlarında (D', oxlar) və ilk faringeal tağlarda (D', oxlar).) CNCC-nin zəif delaminasiyasını və miqrasiyasını göstərən bəzi boyanma (oxlar) ilə.ER) E8.5 (E–L) və E9.5 (M–R) mərhələlərində WT və Specc1l mutant embrionlarının bölmələri NCC markerləri SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) və DLX2 (I, J, Q, R).E8.5-də vəhşi tipli sinir qatında (NF) və mutant bölmələrdə NCC boyanması müşahidə edildi.E8.5 WT (K) və mutantda (L) SOX10 və β-kateninin birgə boyanması sinir qıvrımlarında hüceyrə sərhədlərində artan β-katenin boyanmasını aşkar etdi.E9.5-də miqrasiya edən CNCC-lərin (M, O, Q) vəhşi tipli boyanması müşahidə edildi, mutantlarda təbəqələşməmiş CNCC-lər açıq sinir qıvrımlarını (N, P, R) ləkələdi.(S–Z) E9.5 mutasiyası ilə WT və Specc11DTM096/RRH048 embrionlarının tac bölmələrində in vivo AJ etiketləmə təhlili.Yuxarı sağ küncdə təxmini bölmə müstəvisi göstərilir.Mutant toxumaların bölmələrində F-aktinin (S, T) və miozin IIb (U, V) rənginin artması müşahidə edilmişdir.Şəkil 3-də in vitro nəticələrinə oxşar olaraq mutant embrionlarda β-katenin (W, X) və E-kaderin (Y, Z) üçün gücləndirilmiş membran boyanması müşahidə edildi.(AA-BB) Apikal-bazal hüceyrənin hüdudlarından kənara baxan vəhşi tipli embrionun bir hissəsinin elektron mikroqrafiyası yapışqan birləşmələrin göstəricisi olan fərqli elektron sıx bölgəni göstərir (AA, oxlar).Əksinə, Specc11 mutant embrionlarının bölmələrində (BB, oxlar) bütün apikobazal qovşaq elektron sıxdır, bu da yapışqan birləşmələrin artan sıxlığını və dispersiyasını göstərir.
Qatlanmanın azaldılmasının dəyişdirilmiş AJ ilə bağlı olduğu fərziyyəmizi yoxlamaq üçün biz Specc1l mutant embrionlarının açıq sinir qatlarında AJ etiketlənməsini araşdırdıq (Şəkil 5S-Z).Biz aktin stress lifləri (Şəkil. 5S, T) və aktin lifləri (Şəkil. 5U, V) üzrə miyozin IIB boyanma ilə müşayiət artan lokallaşdırılması artım müşahidə.Əhəmiyyətli olan, hüceyrələrarası sərhədlərdə β-katenin (Şəkil 5W, X) və E-kaderinin (Şəkil 5Y, Z) artan boyanmasını müşahidə etdik.Biz həmçinin E8.5 embrionlarının sinir kıvrımlarında NCC-nin β-kateninlə boyanmasını araşdırdıq (Şəkil 5K, L).β-katenin boyanmasının Specc1l mutant sinir qıvrımlarında daha güclü olduğu ortaya çıxdı (Şəkil 5L və K), AJ dəyişikliklərinin başladığını göstərir.E9.5 embrionlarının kəllə hissələrinin elektron mikroqrafiklərində biz WT ilə müqayisədə Specc1l mutant embrionlarında yenidən diffuz elektron sıx boyanmanın artdığını müşahidə etdik (Şəkil 5AA, BB və S1E-H).Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr SPECC1L-kd U2OS hüceyrələrindəki in vitro nəticələrimizi dəstəkləyir və mutant embrionlarımızda anormal AJ boyanmasının CNCC təbəqələşməsindən əvvəl olduğunu göstərir.
AKT fəaliyyəti ilə E-cadherin sabitliyi arasında məlum antaqonist əlaqəni nəzərə alaraq, 17,28 biz PI3K-AKT siqnalının iştirakını fərz etdik.Bundan əlavə, bəzi mutant embrionlarımızda E9.5-10.5-də ölümcüllükdən (<5%) qaçan və əvəzinə E13.5-də yerləşmiş subepidermal blisterləri müşahidə etdik (Şəkil S3).Subepidermal veziküllər PDGFRα12 əsasında azalmış PI3K-AKT siqnalının əlamətidir.Fantauzzo və başqaları.(2014) PdgfraPI3K/PI3K mutant embrionlarında PDGFRα əsaslı PI3K aktivasiyasının pozulmasının subepidermal veziküllər, sinir borusu qüsurları və yarıq damaq fenotipləri ilə nəticələndiyini bildirdi.Həqiqətən, pan-AKT və aktiv fosforlanmış Ser473-AKT səviyyələri Specc1l mutant toxumalarında in vivo olaraq E9.5 embrion həbsinə qədər azaldı (Şəkil 6A-D).Fosforlanmış Ser473-AKT səviyyələrinin azalması tamamilə in vivo (şəkil 6E) və in vitro (şəkil 6F) pan-AKT səviyyələrinin azalması ilə bağlı ola bilər.In vitro azalma yalnız U2OS hüceyrələri hüceyrə şəklində və AJ sıxlığında dəyişikliklərlə güclü birləşdikdə müşahidə edildi (Şəkil 6D).Beləliklə, məlumatlarımız SPECC1L-nin kraniofasiyal morfogenezdə PI3K-AKT siqnalının yeni müsbət tənzimləyicisi olduğunu göstərir.
(A–E) E8.5 (A,B) və E9.5 (C,D) kəllə bölmələri və ya Specc1l mutant embrionlarından (E) E9.5 lizatları aktiv fosforlanmış S473-AKT və pan-AKT Protein azaldılması səviyyələrini göstərən , nəzarət WT ilə müqayisədə.Western blotting eyni şəraitdə vəhşi tipli lizatlar və mutant lizatlar üzərində aparılmışdır.SPECC1L üçün göstərilən şəkillər bir ləkədən götürülüb.Eyni ləkə çıxarıldı və anti-pan-ACT və β-aktin antikorları ilə yenidən araşdırıldı.E8.5 sinir qıvrımlarında (A, B) Pan-AKT səviyyələri və E9.5 kəllə bölmələrində fosforlanmış S473-AKT səviyyələri əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır.(F) Pan-AKT səviyyələri yüksək birləşmədə yığılmış SPECC1L-kd U2OS hüceyrələrinin lizatlarında oxşar şəkildə azalmışdır.Səhv çubuqları üç müstəqil Western blot kəmiyyətindən SEM-ləri təmsil edir.(GJ) E9.5-də WT embrionlarının bölmələri müvafiq olaraq KI67 və parçalanmış kaspaza 3 ilə boyanmış, hüceyrə proliferasiyasını (G, G') və az apoptotik aktivliyi (H, H') göstərir.Specc11 mutant embrionları müqayisə edilə bilən hüceyrə proliferasiyasını (I) göstərir, lakin apoptoza məruz qalan hüceyrələrin sayı əhəmiyyətli dərəcədə artır (J).
Daha sonra proliferasiya və apoptozun markerlərini araşdırdıq.KI67 boyanması ilə ölçülən WT mutantları üçün 82,5% və Specc1l mutantları üçün 86,5% proliferasiya indeksi ilə E9.5 embrionlarının (Şəkil 6E, I ilə müqayisədə G) çoxalmasında heç bir fərq müşahidə etmədik (p <0.56, Fisher's dəqiq test).Eynilə, embrion həbsə (göstərilmir) (göstərilmir) qədər E8.5-də sinir qıvrımlarında parçalanmış kaspaz 3 üçün boyanma ilə ölçülən apoptozda heç bir fərq müşahidə etmədik.Bunun əksinə olaraq, bütün E9.5 mutant embrionlarında apoptoz əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 6F, H və J).Apoptozun bu ümumi artımı azalmış PI3K-AKT siqnalına və erkən embrion ölümcülliyinə uyğundur29,30,31.
Sonra, kd hüceyrələrimizdə AJ dəyişikliklərində PI3K-AKT siqnalının səbəbkar rolunu təsdiqləmək üçün biz nəzarət və kd hüceyrələrində yolu kimyəvi olaraq dəyişdirdik (Şəkil 7A-F).Bir marker kimi birləşən SPECC1L-kd hüceyrələrində müşahidə edilən hüceyrə formasının dəyişməsi fenotipindən istifadə etdik, biz bunu ən uzun ölçünün (uzunluğun) müvafiq şaquli ölçüyə (en) nisbətindən istifadə edərək kəmiyyətini təyin etdik.Nisbətən yuvarlaq və ya kuboid hüceyrələr üçün 1 nisbəti gözlənilir (Şəkil 7G).Hüceyrə formasına əlavə olaraq, AJ-yə təsirini β-kateninlə boyanma ilə də təsdiqlədik (Şəkil 7A'-F').Wortmannin istifadə edərək PI3K-AKT yolunun inhibə edilməsi nəzarət hüceyrələrində (Şəkil 7A, C) və AJ (Şəkil 7A') hüceyrə formasını dəyişdirmək üçün kifayət idi.PI3K-AKT aktivatoru SC-79 nəzarət hüceyrələrində hüceyrə formasına (Şəkil 7A, E) və ya AJ genişlənməsinə (Şəkil 7A') təsir göstərməmişdir.SPECC1L-kd hüceyrələrində, PI3K-AKT yolunun daha da sıxışdırılması apoptozun artması (Şəkil 7B, D) və in vivo ağır mutantlarımıza uyğun olaraq β-katenin boyanmasında (Şəkil 7B') nəzərəçarpacaq artımla nəticələndi.Əhəmiyyətli olan, PI3K-AKT yolunun aktivləşdirilməsi hüceyrə formasını (Şəkil 7B, F) və AJ fenotiplərini (Şəkil 7B) əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırdı.Hüceyrə şəklində dəyişikliklər hüceyrə yuvarlaqlıq nisbəti (CCR) kimi ölçüldü və yuxarıda təsvir edildiyi kimi əhəmiyyəti üçün müqayisə edildi (Şəkil 7G).Həqiqətən, nəzarət hüceyrələrində (Şəkil 7G, CCR = 1.56), wortmannin müalicəsi müşahidə edilənə bənzər dərəcədə hüceyrə formasını əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdirmək üçün kifayət idi (Şəkil 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) SPECC1L-də.-kd hüceyrələri (Şəkil 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd hüceyrələrinin Wortmannin müalicəsi (Şəkil 7G, CCR = 3.60, əhəmiyyətsizdir) müalicə olunmamış kd hüceyrələrindən (Şəkil 7G, CCR = 3.46, əhəmiyyətsizdir) və ya wortmannin ilə müalicə olunan nəzarət hüceyrələrindən (Şəkil 7G) daha əhəmiyyətli deyildi., CCR = 3.46, əhəmiyyətsiz) əlavə olaraq hüceyrə uzanmasına təsir göstərir (7G, CCR = 3.61, əhəmiyyətsiz).Ən əsası, SC-79 AKT aktivatoru SPECC1L-kd hüceyrələrinin uzanmış fenotipini bərpa etdi (Şəkil 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Bu nəticələr SPECC1L-nin PI3K-AKT siqnalını tənzimlədiyini təsdiqləyir və SPECC1L-də orta dərəcədə azalmanın hüceyrə yapışmasına təsir etdiyini, güclü azalma isə apoptoza səbəb olduğunu göstərir (Şəkil 8).
(A–F') PI3K-AKT yolunun inhibitoru wortmannin (C, D) və ya SC-79 aktivatoru (E, F) ilə müalicə olunan nəzarət (A, C, E) və SPECC1L-kd (B, D, F) hüceyrələri Müalicə .Müalicə olunmamış nəzarət hüceyrələri normal β-pişik hüceyrə boyanması (A') ilə kuboid (A), kd hüceyrələri isə artan β-pişik boyaması (B') ilə uzanır (B).PI3K-AKT yolunun sıxışdırılmasından sonra nəzarət hüceyrələri β-pişik genişlənməsi (C') ilə uzandı (C), kd hüceyrələri isə bizim yüksək mutasiyaya uğramış embrionlarımıza bənzər və son dərəcə inkişaf etmiş β-pişiyi göstərən apoptoza (D) keçməyə başladı.boyanma (D').PI3K-AKT yolunun aktivləşdirilməsindən sonra nəzarət hüceyrələri kuboid (E) olaraq qaldı və normal β-pişik (E') boyandı, kd hüceyrələri isə əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşmış hüceyrə forması (F) və β-pişik (F') boyanmasını göstərdi. (G) (AF) hüceyrə formasının dəyişmə dərəcəsi MetaMorph proqram təminatından istifadə edərək ən uzun ölçünün (uzunluq) və müvafiq şaquli ölçünün (en) hüceyrə yuvarlaqlıq nisbətindən (CCR) istifadə etməklə ölçüldü.Müalicə olunmamış (NT) SPECC1L-kd hüceyrələri (CCR = 3.46) nəzarət hüceyrələrindən əhəmiyyətli dərəcədə uzun idi (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Wortun nəzarət hüceyrələrində PI3K-AKT yolunu inhibə etməsi hüceyrə şəklində oxşar uzanmaya səbəb olmaq üçün kifayət idi (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Eynilə, SPECC1L-kd hüceyrələrində SC-79 tərəfindən AKT aktivləşdirilməsi nəzarət səviyyələrinə qədər hüceyrə uzanmasını bərpa etdi (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).SPECC1L-kd hüceyrələrinin wortmanninlə müalicəsi apoptozun artması ilə nəticələndi, lakin .ns = fərqi yoxdur.+/- 50 hüceyrə üçün SEM ölçmələri göstərilir.Statistik fərqlər Student's t-testindən istifadə etməklə hesablanmışdır.
(A) müvafiq olaraq AJ dəyişiklikləri və xilasetmə ilə nəticələnən PI3K-AKT yolunun inhibisyonu və aktivləşdirilməsinin sxematik təsviri.(B) SPECC1L ilə AKT zülalının sabitləşməsi üçün təklif olunan model.
Premigratory CNCCs AJ lizisin ön sinir qatının neyroepitelial hüceyrələrindən ayrılmasını tələb edir1,15,32.SPECC1L-nin β-kateninə fiziki yaxınlığı ilə birlikdə həm in vitro, həm də in vivo olaraq SPECC1L çatışmazlığı olan hüceyrələrdə AJ komponentlərinin artan rənglənməsi və apikal-bazal AJ asimmetrik paylanmasının itirilməsi, SPECC1L-nin AJ-nin yerli sabitliyini lazımi səviyyədə saxlamaq üçün funksiyasını yerinə yetirdiyini göstərir. təşkilat əzələləri.aktin sitoskeleti.SPECC1L-nin aktin sitoskeleti və β-katenin ilə əlaqəsi və SPECC1L olmadıqda qatılaşdırılmış aktin filamentlərinin sayının artması AJ sıxlığında müşahidə olunan artımla uyğundur.Başqa bir ehtimal, SPECC1L çatışmazlığı olan hüceyrələrdə aktin liflərinin sayının artmasının hüceyrələrarası gərginliyin dəyişməsinə səbəb olmasıdır.Hüceyrə stressi AJ 33 dinamikasına təsir etdiyi üçün gərginlik dəyişiklikləri daha çox yayılmış AJ 34 ilə nəticələnə bilər.Beləliklə, hər hansı bir dəyişiklik CNCC təbəqələrinə təsir edəcəkdir.
Wnt1 sinir qabığı hüceyrələrinə səbəb olan erkən sinir qıvrımlarında ifadə edilir.Beləliklə, Wnt1-cre nəsil izləmə həm əvvəlcədən, həm də köç edən NCC35-i qeyd edir.Bununla belə, Wnt1 həm də erkən sinir qıvrımlarından əldə edilən dorsal beyin toxuması klonlarını qeyd edir 35,36, açıq sinir qatlarında Wnt1 markerləri üçün E9.5 mutantlarının rənglənməsinin CNCC olmadığını ehtimal edir.NCC markerləri AP2A və SOX10 üçün müsbət boyanmamız təsdiqlədi ki, Specc11 mutant embrionlarının ifşa olunmuş sinir qıvrımlarında həqiqətən də CNCC var.Bundan əlavə, AP2A və SOX10 erkən miqrasiya edən NCC-nin markerləri olduğundan, müsbət rəngləmə bu hüceyrələrin E9.5 ilə təbəqələşdirilə bilməyən post-miqrasiya CNCC olduğunu göstərdi.
Məlumatlarımız göstərir ki, AJ-nin SPECC1L tərəfindən molekulyar tənzimlənməsi PI3K-AKT siqnalı ilə vasitəçilik edir.SPECC1L çatışmazlığı olan hüceyrələrdə və toxumalarda AKT siqnalı azalır.Fantauzzo və başqalarının tapıntıları.kraniofasiyal morfogenezdə PI3K-AKT siqnalının birbaşa rolunu dəstəkləyir.(2014) göstərdi ki, PDGFRα əsaslı PI3K-AKT siqnalının aktivləşdirilməsinin olmaması yarıq damaq fenotipinə gətirib çıxarır.Biz həmçinin göstəririk ki, PI3K-AKT yolunun inhibəsi U2OS hüceyrələrində AJ və hüceyrə formasını dəyişdirmək üçün kifayətdir.Tapıntılarımıza uyğun olaraq, Cain et al.37 göstərdi ki, endotel hüceyrələrində PI3K α110 alt bölməsinin aşağı tənzimlənməsi "bağlanma indeksində" artım olaraq adlandırılan pericellular β-katenin boyanmasında oxşar artımla nəticələnir.Bununla belə, aktin filamentləri artıq yüksək səviyyədə təşkil edilmiş endotel hüceyrələrində PI3K-AKT yolunun boğulması boş hüceyrə forması ilə nəticələnir.Bunun əksinə olaraq, SPECC1L-kd U2OS hüceyrələri uzanmış hüceyrə formasını göstərdi.Bu fərq hüceyrə tipinə xas ola bilər.PI3K-AKT siqnalının yatırılması aktin sitoskeletonuna daimi təsir göstərdiyi halda, hüceyrə formasına təsir mərkəzi aktin liflərinin sıxlığı və təşkilində dəyişikliklər nəticəsində yaranan gərginlik dəyişiklikləri ilə müəyyən edilir.U2OS hüceyrələrində biz SPECC1L çatışmazlığı olan AJ dəyişikliyi və bərpasının markeri kimi yalnız hüceyrə forma dəyişikliklərindən istifadə etdik.Nəticə olaraq, SPECC1L çatışmazlığında AKT yolunun inhibe edilməsinin AJ sabitliyini artırdığını və CNCC-də delaminasiyanı azaltdığını fərz edirik.
Maraqlıdır ki, pan-AKT səviyyələri in vitro və in vivo olaraq fosforlanmış 473-AKT səviyyələrinə əlavə olaraq SPECC1L olmadıqda azaldı, bu da AKT protein sabitliyi və ya dövriyyəsi səviyyəsində PI3K-AKT siqnalının tənzimlənməsini təklif edir.Opitz/GBBB sindromu ilə əlaqəli SPECC1L və MID1 genləri mikrotubulları sabitləşdirən zülalları kodlayır 18,22.SPECC1L və MID1-in mikrotubulun sabitləşməsinə vasitəçilik etdiyi mexanizm tam başa düşülməyib.SPECC1L vəziyyətində bu sabitləşmə mikrotubulların 18 alt dəstinin gücləndirilmiş asetilasiyasını əhatə edir.SPECC1L-nin AKT kimi digər zülalları sabitləşdirmək üçün oxşar mexanizmdən istifadə etməsi mümkündür.Göstərilmişdir ki, AKT zülalında lizin qalıqlarının asetilləşməsi membranın lokalizasiyasının və fosforlaşmanın azalmasına gətirib çıxarır38.Bundan əlavə, K63 zəncirinin AKT-də eyni lizin qalığında ubiquitinasiyası onun membran lokalizasiyası və aktivləşməsi üçün tələb olunur39,40.Müxtəlif yüksək məhsuldarlıqlı maya iki hibrid ekranlarında müəyyən edilmiş SPECC1L zülalları ilə qarşılıqlı təsir göstərən bir neçə amil arasında dördü - CCDC841, ECM2942, APC və UBE2I43 - ubiquitination və ya sumoilasiya yolu ilə zülal dövriyyəsi və ya sabitliyinə təsir göstərmişdir.SPECC1L AKT sabitliyinə təsir edən AKT lizin qalıqlarının translasiyadan sonrakı modifikasiyasında iştirak edə bilər.Bununla belə, AKT zülalının lokalizasiyasında və sabitliyində SPECC1L-nin kritik rolu hələ də aydınlaşdırılmalıdır.
In vivo SPECC1L ifadəsindəki ciddi qüsurlar AJ markerinin boyanmasının artmasına və qüsurlu CNCC örtüyünə, həmçinin apoptozun və erkən embrion ölümcüllüyünün artmasına səbəb oldu.Əvvəlki hesabatlar göstərdi ki, apoptoz səviyyəsi artan siçan mutantları sinir borusu qüsurları 44,45,46,47 və kəllə-üz qüsurları48 ilə əlaqələndirilir.Sinir qıvrımlarında və ya faringeal tağlarda həddindən artıq hüceyrə ölümünün düzgün morfogenetik hərəkət üçün lazım olan qeyri-kafi sayda hüceyrə ilə nəticələnə biləcəyi irəli sürülür 48,49,50.Bunun əksinə olaraq, orta dərəcədə azalmış SPECC1L ifadəsi olan SPECC1L çatışmazlığı olan hüceyrə xətlərimiz artan hüceyrə ölümünün sübutu olmadan yalnız AJ dəyişikliklərini göstərdi.Bununla belə, bu Kd hüceyrələrində PI3K-AKT yolunun kimyəvi inhibəsi apoptozun artması ilə nəticələndi.Beləliklə, SPECC1L ifadəsində və ya funksiyasında orta dərəcədə azalma hüceyrə sağ qalmasını təmin edir.Bu, st-də həbsdən qaçan nadir Specc11 mutant embrionlarının müşahidəsi ilə uyğundur.E9.5 - bəlkə də gen tutma səmərəliliyinin azalması səbəbindən - sinir borularını bağlaya və inkişafı daha sonra dayandıra bilirlər, tez-tez kraniofasiyal qüsurlarla (Şəkil S3).Bununla yanaşı, heterozigot Specc1l embrionlarının kraniofasiyal anomaliyaları ilə nadir rast gəlinməsi - ehtimal ki, gen tutma səmərəliliyinin artması ilə əlaqədardır - həmçinin zebra balığında iki SPECC1L ortoloqundan birinin (specc1lb) gec embrion fenotiplərinin itirilməsinə səbəb olduğu tapıntıdır. alt çənələr və ikitərəfli yarıqlar51.Beləliklə, insan xəstələrdə müəyyən edilmiş heterozigotlu SPECC1L funksiyasının itirilməsi mutasiyaları kraniofasiyal morfogenez zamanı SPECC1L funksiyasında kiçik pozğunluqlara səbəb ola bilər ki, bu da onların orofasiyal yarıqlarını izah etmək üçün kifayətdir.Hüceyrələrarası təmasların SPECC1L əsaslı tənzimlənməsi də faringeal tağların palatogenezində və birləşməsində rol oynaya bilər.SPECC1L funksiyasının sonrakı tədqiqatları neyroepitelial hüceyrə hərəkətliliyində və kraniofasiyal morfogenezdə sinir borusu bağlanması zamanı CNCC-də müvəqqəti hüceyrələrarası kontaktların rolunu aydınlaşdırmağa kömək edəcəkdir.
U2OS osteosarkoma nəzarəti və SPECC1L-kd hüceyrələri daha əvvəl təsvir edilmişdir (Saadi et al., 2011).SPECC1L-ə qarşı antikorlar da əvvəllər xarakterizə edilmişdir (Saadi et al., 2011).Anti-β-katenin antikorları (dovşan; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (siçan; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miyozin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis) ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego) , Kaliforniya), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), parçalanmış kaspaza 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) və β-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) təsvir edildiyi kimi istifadə edilmişdir..Aktin filamentləri Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Kolorado) ilə boyandı.
U2OS nəzarət hüceyrələri və SPECC1L-kd hüceyrələri 10% fetal iribuynuzlu zərdab (Life Technologies, Carlsbad, CA) ilə əlavə edilmiş standart yüksək qlükoza DMEM-də becərildi.AJ dəyişiklikləri üçün 2 x 105 hüceyrə 0,1% donuz jelatini (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO) ilə işlənmiş şüşəyə səpildi və hüceyrə şəklində dəyişikliklər üçün müşahidə edildi.Hüceyrələr müxtəlif göstərilən vaxt nöqtələrində toplandı: toxumdan 4 saat sonra (t = 1), toxumdan 24 saat sonra (t = 2), hüceyrə şəklində dəyişmədən birləşmə (t = 3), hüceyrə şəklində dəyişiklik (t = 4) , hüceyrə formasının dəyişməsindən 24 saat sonra (t = 5) və hüceyrə formasının dəyişməsindən 48 saat sonra (t = 6) (Şəkil 1, 2, 3).PI3K-AKT yolunu modulyasiya etmək üçün hüceyrələr PI3K-AKT inhibitoru wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) və ya SC-79 aktivatoru (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) ilə göstərilən konsentrasiyalarda becərildi.Tərkibində kimyəvi maddələr olan mühit gündəlik dəyişdirilir.
Normal mədəniyyət şəraitində canlı nəzarət və KD hüceyrələrində kadr-kadr qeydləri aparıldı və 7 gün ərzində hər 10 dəqiqədən bir faza kontrastlı şəkillər toplandı.Şəkillər mexaniki mərhələ və QImaging Retiga-SRV kamerasına qoşulmuş 10 × N-PLAN obyektiv ilə təchiz edilmiş kompüterlə idarə olunan Leica DM IRB ters çevrilmiş mikroskopdan istifadə etməklə əldə edilmişdir.Görüntüləmə zamanı hüceyrə mədəniyyətləri 5% CO2 ilə nəmli bir atmosferdə 37 ° C-də saxlanıldı.
Regional Mutant Siçan Resurs Mərkəzindən (UC Davis, CA) iki gen tələsi ES hüceyrə xətti DTM096 və RRH048 Specc1lgtDTM096 və Specc1lgtRRH046 təyin edilmiş Specc11 çatışmazlığı olan siçan xətlərini yaratmaq üçün istifadə edilmişdir.Qısaca olaraq, 129/REJ ES hüceyrələri C57BL6 blastokistlərinə yeridildi.Alınan kimerik erkək siçanlar, aquti palto rəngi olan nəslini müəyyən etmək üçün dişi C57BL6 siçanları ilə yetişdirildi.Heterozigotları müəyyən etmək üçün gen tələsinin vektor əlavələrinin olmasından istifadə edilmişdir.Siçanlar 129/REJ;C57BL6 qarışıq fonunda saxlanılıb.Genetik tələ vektorunun daxil olduğu yerin yeri RT-PCR, genom ardıcıllığı və genetik tamamlama ilə təsdiqləndi (Əlavə Şəkil 1).İkiqat heterozigotlu Specc1lGT siçanlarının CNCC nəslini izləmək üçün ROSAmTmG (#007576) və Wnt1-Cre (#003829) siçanları (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) embriyolarda ROSAmTmG və Wnt1-Cre mutantını istehsal etmək üçün keçildi.Siçanlar üzərində bütün təcrübələr Kanzas Tibb Mərkəzi Universitetinin İnstitusional Heyvanlara Baxım və İstifadə Komitəsi tərəfindən təsdiq edilmiş protokollara uyğun olaraq həyata keçirilib.
Embrionlar otaq temperaturunda 60 dəqiqə ərzində (1% formaldehid, 0,2% glutaraldehid, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) fiksasiya edilmişdir.X-gal boyama məhlulunda (5 mM kalium ferrisiyanid, 5 mM kalium ferrosiyanid, 2 mM MgCl2, 0.01% natrium deoksixolat, 0.02% NP-40, 1 mq/ml X-gal) fiksasiya edildikdən sonra ləkənin inkişafı 37°C-də aparıldı. .1-6 saat ərzində °C.Embrionlar 4% PFA-da post-fiksasiya edilib və vizuallaşdırılıb.
Western blotting üçün hüceyrələr HALT proteaz inhibitorlarının (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) qarışığı ilə əlavə edilmiş passiv lizis tamponunda (Promega, Fitchburg, WI) parçalandı.Lizatlar 12% poliakrilamid Mini-PROTEAN TGX hazır gellərində (Bio-Rad, Hercules, CA) işlənmiş və Immobilon PVDF membranlarına (EMD Millipore, Billerica, MA) köçürülmüşdür.Membranlar 0,1% Tween ehtiva edən PBS-də 5% süddə bloklandı.Antikorlar gecə ərzində 4°C-də və ya bir saat otaq temperaturunda inkubasiya edilmişdir.Siqnal yaratmaq üçün Femto SuperSignal West ECL reagentindən (Thermo Scientific, Waltham, MA) istifadə edilmişdir.İmmun boyama üçün embrionlar bir gecədə 4% PFA/PBS-də fiksasiya edilib və dondurulub.1% normal keçi serumu (Thermo Scientific, Waltham, MA) və 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) olan PBS-də toxuma kriozeksiyaları bloklandı və sonra inkubatorda 4°C-də inkubasiya edildi. gecə.anti-antikor və flüoresan ikincil anticisim (1:1000) ilə 4°C-də 1 saat ərzində.Ləkələnmiş kəsiklər ProLong qızıl mühitinə (Thermo Scientific, Waltham MA) yerləşdirildi və Leica TCS SPE konfokal mikroskopundan istifadə edərək düz təsvirlər əldə edildi.Hər bir immun boyama ən azı iki mutant embrionun cirossectionları üzərində üç müstəqil təcrübə kimi həyata keçirilmişdir.Nümunəvi təcrübə göstərilir.
Hüceyrələr dəyişdirilmiş RIPA tamponunda (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% qliserin, 2 mM EDTA və HALT proteaz inhibitorunda (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) inkubasiya edilmişdir. Qısaca olaraq, lizatlar protein G maqnit muncuqları (Life Technologies, Carlsbad, CA) ilə əvvəlcədən təmizləndi və sonra gecə ərzində 4°C-də inkubasiya edildi. SPECC1L-ni çıxarmaq üçün anti-SPECC1L və ya IgG protein G zülal muncuqları istifadə edildi və anti-bloklama istifadə edərək Western blotting həyata keçirildi. Yuxarıda təsvir edilən -β-katenin antikoru Göstərilən co-IP təcrübələri dörd müstəqil təcrübəni təmsil edir.
Sabit mədəni hüceyrələr və ya siçan embrion toxumaları Kanzas Universitetinin Tibb Mərkəzindəki elektron mikroskopiya mərkəzinə təqdim edildi.Qısaca olaraq, nümunələr EMbed 812 qatranına (Elektron Mikroskopiya Elmləri, Fort Vaşinqton, Pensilvaniya) daxil edildi, bir gecədə 60°C-də polimerləşdi və almaz bıçaqla təchiz olunmuş Leica UC7 ultramikrotomundan istifadə edərək 80 nm-də kəsildi.Bölmələr 100 kV-luq Lab6 silahı ilə təchiz edilmiş JEOL JEM-1400 ötürücü elektron mikroskopu ilə vizuallaşdırıldı.
Bu məqaləyə necə istinad etmək olar: Wilson, NR et al.SPECC1L çatışmazlığı birləşdirilmiş oynaqların sabitliyinin artmasına və kranial sinir qabığının hüceyrələrinin delaminasiyasının azalmasına səbəb olur.elm.6, 17735;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Sinir qabığının induksiyası və differensasiyası.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR və başqaları.Hərəkətdə olan kranial sinir qabığı hüceyrələri: kraniofasiyal inkişafda rolu.American Journal of Medical Genetics.Hissə A 155A, 270–279, doi: 10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: 20 il ərzində böyüməsi və inkişafı.Pediatr.patologiyası.laboratoriya.dərman.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU və Noten MM Orofasiyal yarıqların genetikasında sıçrayış.Trends in Molecular Medicine 17, 725-733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. və Riley, FM Kranial sinir uclarının hüceyrə miqrasiyası və kraniofasiyal inkişafı zamanı modelləşdirmənin molekulyar mexanizmləri.İnkişaf 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH və Murray, JK Yarıq dodaq və damaq: genetik və ətraf mühitin təsirlərini başa düşmək.təbii şərh.Genetika 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.İnterferon tənzimləyən faktor-6 (Irf6) çatışmazlığı olan siçanlarda dərinin, əzaların və kraniofasiyal bölgənin anormal morfogenezi.Milli Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Canvid, M. et al.GRHL3-də dominant mutasiyalar van der Waord sindromuna səbəb olur və ağız peridermasının inkişafını pozur.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ və Juriloff, DM Sinir borusunun bağlanmasında qüsurları olan siçan mutantlarının siyahısını yeniləyin və sinir borusunun bağlanmasının tam genetik anlayışına doğru irəliləyin.Anadangəlmə qüsurların tədqiqi.Hissə A, Klinik və Molekulyar Teratologiya 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K vasitəçiliyi ilə işləyən PDGFRalpha siqnalı p53-dən asılı hüceyrədaxili yol vasitəsilə skelet inkişafında sağ qalmağı və yayılmasını tənzimləyir.Gen İnkişafı 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND və Murdoch, JN Disheveled: Konvergent genişlənmənin sinir borusunun bağlanması ilə əlaqəsi.Nevrologiyada meyllər.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).