347 paslanmayan poladdan bükülmüş boru kimyəvi komponenti, Çapraz bağlı kütləvi spektrometriyadan (CLMS) istifadə edərək yeni interferona cavab verən insan leykosit antigen-A (HLA-A) şaperon zülallarının müəyyən edilməsi

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.
Hər slaydda üç məqalə göstərən slayderlər.Slaydlar arasında hərəkət etmək üçün geri və sonrakı düymələrdən və ya hər slaydda hərəkət etmək üçün sonundakı slayd nəzarətçi düymələrindən istifadə edin.

Məhsul təsviri

Paslanmayan Polad 347L Bobin Boruları, Polad Dərəcəsi: SS347L

İnterferon siqnal sistemi ətraf mühitdən gələn geniş spektrli patogen və daxili patoloji siqnallara güclü sitokin reaksiyası yaradır, nəticədə interferonla induksiya olunan zülalların alt qruplarının induksiyası baş verir.İnterferon-induksiya edilmiş zülallar sahəsində yeni protein-zülal qarşılıqlı təsirlərini aşkar etmək üçün DSS vasitəçiliyi ilə çarpaz əlaqə kütlə spektrometriyasını (CLMS) tətbiq etdik.Gözlənilən interferon-induksiya olunan zülallara əlavə olaraq, MX1, USP18, OAS3 və STAT1 kimi kanonik interferon-induksiya olunan zülalların yeni molekullararası və intramolekulyar çarpaz bağlı əlavələrini də müəyyən etdik.Biz HLA-A zülalları (H2BFS-HLA-A-HMGA1) tərəfindən yaradılmış interferon-induksiya olunan zülal şəbəkələrinin yeni dəstinin ortoqonal yoxlanılmasına və onların molekulyar dinamika modelləşdirməsindən istifadə edərək gələcək tədqiqinə diqqət yetirdik.Zülal kompleksinin konformasiya dinamikasının modelləşdirilməsi CLMS tapıntılarında müəyyən edilmiş qarşılıqlı təsirləri əks etdirən bir neçə qarşılıqlı əlaqə sahəsini aşkar etdi.Birlikdə biz interferon tərəfindən törədilən yeni siqnal komplekslərini müəyyən etmək üçün CLMS-in pilot tədqiqatını təqdim edirik və şiş mikromühitində zülal qarşılıqlı təsirlərinin yeni dinamikasını müəyyən etmək üçün CLMS-in daha geniş istifadəsini gözləyirik.
Adaptiv immun cavab başlamazdan əvvəl, ev sahibinin fitri müdafiə sistemi interferonlar (IFNs) adlanan ifraz olunmuş alfa-spiral sitokinlər ailəsinin vasitəçiliyi ilə antimikrobiyal reaksiya yaradır.Tip I IFN sinifləri IFNα və IFNβ antiviral, proapoptotik, proinflamatuar və antiproliferativ vəziyyətlər daxil olmaqla hüceyrə reaksiyalarını aktivləşdirir.İnsanlarda IFNα-nın 13 alt növü məlumdur, hamısı 91-ci xromosomda toplanır. Təəccüblüdür ki, klinik istifadə üçün yalnız IFNα2 tədqiq edilmişdir.Bu yaxınlarda IFNα-nın digər alt növləri üzrə tədqiqatlara xüsusi diqqət yetirilmişdir.Son tədqiqat göstərdi ki, IFNα14 kanonik IFNα2 alt növü ilə müqayisədə HBV2 və HİV-13,4 replikasiyasını məhdudlaşdıran ən təsirli izoformalardan biridir.
Müəyyən edilmişdir ki, aktivləşdirilmiş tip I interferon reseptor kompleksləri (IFNAR1 və IFNAR2) Janus kinazlarının TYK2 və JAK15,6 vasitəçiliyi ilə siqnal ötürülməsi kaskadını tetikler.Bu Janus kinazları SH2 domeninin vasitəçiliyi ilə heterodimerləşməni başlatmaq üçün tirozin qalıqları üzərində siqnal ötürücüləri və transkripsiya zülal aktivatorlarını (STAT1 və STAT2) fosforilləşdirir6.Sonradan, IRF9 nüvəyə köçən və 2000-dən çox interferon-stimullaşdırılmış genin (ISGs) transkripsiyasını induksiya edən IFN-stimullaşdırılmış faktor 3 geninin (ISGF3) trimerik kompleksini yaratmaq üçün STAT heterodimerlərini bağlayır5,6,7,8.
ISGs, xüsusilə viral hücuma cavab olaraq, anadangəlmə immun sisteminin əsasını təşkil edir.Viral infeksiyaya qarşı ilk müdafiə xətti olaraq hüceyrələr geniş bioloji fəaliyyət spektri ilə hüceyrə zülallarının geniş qarşılıqlı təsirini sürətlə həyata keçirir.Bu zülallara nümunənin tanınması reseptorları, siqnal molekulları, transkripsiya faktorları və birbaşa antiviral funksiyaları olan zülallar, həmçinin immun cavabların mənfi tənzimləyiciləri daxildir9.ISG fəaliyyəti haqqında məlumatın çoxu, fərdi ISG-lərin ifadə edildiyi və ya inhibə edildiyi və onların fəaliyyətinin müxtəlif viruslar üzərində sınaqdan keçirildiyi həddindən artıq ifadə ekranlarından10,11 və ya gen susdurma üsullarından (siRNA, RNAi və CRISPR)12,13 istifadə edən funksional ekranlardan gəlir.Bu tədqiqatlar fərdi ISG-lərin antiviral xüsusiyyətlərini müəyyən etsə də, hər bir ISG-nin əsas molekulyar mexanizmləri böyük ölçüdə naməlum olaraq qalır.Ümumiyyətlə qəbul edilir ki, bir çox zülallar tam aktivliyi təmin etmək üçün bir və ya bir neçə sitokinlə qarşılıqlı əlaqədə olur, buna görə də ya ISG-lər birbaşa qarşılıqlı əlaqə qurur, ya da onların qarşılıqlı əlaqəsi hüceyrə zülalları vasitəsilə həyata keçirilir.Məsələn, son fotokrosslinked proteomika tədqiqatı ATPase VCP/p97-ni əsas IFITM3 qarşılıqlı tərəfdaşı kimi müəyyən etdi, onun inhibe edilməsi IFITM3-ün viral hissəciklərlə 14 lizosomal çeşidlənməsi, dövriyyəsi və kotransportunda qüsurlara gətirib çıxarır.İmmunopresipitasiyadan istifadə edərək, veziküllə əlaqəli zülal olan VAPA-nı xolesterinin vasitəçiliyi ilə viral olgunlaşmaya vasitəçilik edən IFITM1/2/3 ilə qarşılıqlı əlaqə partnyoru kimi müəyyən etdik və bu, maya iki hibrid sistemindən istifadə edən başqa bir araşdırma ilə təsdiqləndi.Elmi dəstək 15, 16.
İnfeksiyanın və bədxassəli transformasiyanın yatırılmasında iştirak edən əsas bioloji proses əsas histouyğunluq kompleksi (MHC) molekullarının vasitəçilik etdiyi antigen təqdimatıdır.Parçalanmış, vaxtından əvvəl dayandırılmış və ya səhv qatlanmış zülallardan peptidlər (uzunluğu 8-12 amin turşusu) MHC-I heterodimerinə yüklənir (mHC-I ağır və yüngül zəncirlərdən ibarətdir, β-2-mikroqlobulin adlanır; β2M) 17,18 .Nəticədə sabit MHC-I trimerləri hüceyrə səthinə daşınır və burada hüceyrədaxili peptidləri CD8+ T hüceyrələrinə (sitotoksik T hüceyrələri)17 təqdim edirlər.T hüceyrələri bu patogenləri və şişə xüsusi antigen daşıyan hüceyrələri tanıyır və məhv edir.Nəticə etibarilə, patogenlər və şiş hüceyrələri immun nəzarətdən qaçmaq üçün tez-tez antigen təqdimetmə prosesini boğur.Bundan əlavə, MHC-I insan şişlərinin 40-90%-də aşağı tənzimlənir və tez-tez daha pis proqnozla əlaqələndirilir19.
Patogenlərə cavab verən genlər tez bir zamanda istirahət və aktiv transkripsiya vəziyyəti arasında keçid etməlidirlər.Buna görə də, bir neçə hüceyrə zülalının qısa müddət ərzində yüksək IFN tələbatına cavab reaksiyasında, o cümlədən promotor xromatinin 20,21 modifikasiyası və modifikasiyası kimi fərziyyələr irəli sürülür.Əksər tədqiqatlar IFN varlığında fərdi ISG protein partnyorlarının müəyyən edilməsinə yönəlmişdir.Model hüceyrə sistemlərində bir neçə proteomik və transkriptomik tədqiqatlar IFN-nin hüceyrə mənzərəsinə təsirini aydınlaşdırdı.Bununla belə, interferonların yaratdığı dinamika haqqında artan anlayışa baxmayaraq, biz hələ də ISG-lərin iştirakı haqqında çox az şey bilirik.İnterferon siqnalizasiyasının mürəkkəbliyini və zamandan asılı dinamikasını nəzərdən keçirərkən iki sual yaranır: (i) sürətli siqnalda iştirak edən multiprotein komplekslərini sabitləşdirmək və tutmaq mümkündürmü və (ii) bu qarşılıqlı təsirləri 3D məkanda təsvir etmək olarmı?
Bu problemləri həll etmək üçün IFNα ilə induksiya olunan zülal qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsini və onun dinamikasını öyrənmək üçün kütləvi spektrometriya (CLMS) ilə birlikdə disuksinimid suberat vasitəçiliyi ilə kimyəvi çarpaz əlaqə (DSS) tətbiq etdik.DSS in vivo zülalların və/və ya protein komplekslərinin proksimal qalıqları arasında kovalent bağlar əlavə edir.Sonrakı MS təhlili, daxili əlaqələr adlanan müəyyən bir zülal daxilində bölgələrin məkan yaxınlığını əks etdirən spesifik çarpaz əlaqə saytlarını aşkar edir və ya zülal komplekslərindəki alt bölmələr, qarşılıqlı əlaqə adlanır.Bu yanaşmadan istifadə edərək, biz bir neçə yeni protein-zülal kompleksini, eləcə də interferon-induksiya etdiyi multiprotein qarşılıqlı şəbəkələrini müəyyən etdik.Bu yeni qarşılıqlı təsirlərin alt çoxluğunu sınaqdan keçirərək, H2BFS (H2B histon tipli FS; bundan sonra H2B adlandırılacaq) və MDN1-nin HLA-A üçün məcburi tərəfdaş kimi çıxış etdiyini nümayiş etdiririk.
Flo-1 hüceyrələri özofagus adenokarsinomasının ən yaxşı tanınan in vitro modellərindən biridir, çünki onlar özofagus şişlərinin əsas xüsusiyyətlərini təqlid edirlər22,23.Bununla belə, bütün şişlər immunogen deyil və Flo-1 hüceyrələrinin interferon müalicəsinə cavab verib-vermədiyini müəyyən etmək üçün biz Flo-1 hüceyrələrini 72 saat ərzində 10 ng/ml IFNα ilə müalicə etdik.Flo-1 hüceyrələri müalicədən 2 saat sonra başlayan və 72 saat davam edən, IRF1-in stasionar səviyyələrində zamandan asılı olaraq azalma ilə pSTAT1 və IRF1-in erkən induksiyasını göstərdi (Şəkil 1A).ISG-lərin (MX1, IFITM1, OAS1/2 və ISG15) IFNα-ya klassik orta və gec faza cavablarını təqlid edərək, 6 saatdan sonra güclü şəkildə induksiya olunduğu aşkar edilmişdir (Şəkil 1A).Birlikdə, bu məlumatlar bu hüceyrə modelinin interferon reaksiyalarını öyrənmək üçün istifadə edilə biləcəyini göstərir.
IFNa ilə müalicədən sonra Flo-1 hüceyrələrində diferensial protein ifadə reaksiyaları.(A) 2, 6, 24, 48 və 72 saat ərzində 10 ng/ml IFNα ilə müalicə edilmiş Flo-1 hüceyrələrində zülal ifadəsi göstərilən ISG antikorlarından istifadə edərək immunoblotla təhlil edilmişdir.(B) Göstərilən vaxtlar və konsentrasiyalar üçün DSS ilə çarpaz əlaqədən sonra bütün hüceyrə ekstraktlarının Coomassie mavi ləkələnmiş SDS-PAGE gelləri.(C) Nümayəndə immunoblot eyni nümunələrdən p53(DO-1) antikoru ilə zülalların çarpaz əlaqə dərəcəsini qiymətləndirmək üçün araşdırıldı.
Yerində zülal qarşılıqlı mənzərəsini çəkmək üçün yüksək membran keçiriciliyi və nisbətən qısa reaksiya müddəti sayəsində geniş istifadə olunan çarpaz birləşdirici agent olan DSS-dən istifadə etdik.Daha qısa reaksiya müddəti çarpaz bağlanmış zülalların böyük aqreqatlarının əmələ gəlməsinin qarşısını almağa kömək edir və bununla da çarpaz bağlayıcının sabitliyini qoruyur.Optimal DSS konsentrasiyasını müəyyən etmək və həddən artıq çarpaz əlaqənin qarşısını almaq üçün əvvəlcə hüceyrələri 5, 10, 5 və 30 dəqiqə ərzində müvafiq olaraq 5, 2.5 və 1 mM DSS-ə məruz qoyduq və Coomassie ilə boyanmış SDS-PAGE ilə lizatları təhlil etdik. (məlumatlar göstərilmir).Hüceyrə lizatları ən aşağı konsentrasiyada və ən qısa zaman nöqtəsində yüksək dərəcədə çarpaz bağlı görünür.Buna görə də, DSS 5 dəqiqə ərzində 1, 0,5 və 0,1 mM titrə edilmişdir (Şəkil 1B).Optimal çarpaz əlaqə 5 dəqiqə ərzində 0,5 mM DSS ilə müşahidə edildi və bu şərtlər IFNa ilə müalicə olunan hüceyrələr üçün seçildi.Bundan əlavə, Şəkil 1C zülalların çarpaz əlaqə dərəcəsini qiymətləndirmək üçün p53 (DO-1) antikorundan istifadə edərək həyata keçirilən Western blotunu göstərir.
Flo-1 hüceyrələri çarpaz bağlayıcı əlavə edilməzdən əvvəl 24 saat ərzində 10 ng/ml IFNα ilə müalicə olundu.Çapraz bağlı hüceyrələr sonradan iki mərhələli proteolizlə parçalanmış və zülallar FASP (Şəkil 2)24,25 ilə işlənmişdir.Çapraz bağlı triptik peptidlər kütləvi spektrometriya ilə təhlil edilmişdir (şəkil 2).MS/MS spektrləri daha sonra zülal ardıcıllığına uyğunlaşdırılır və MaxQuant26,27 ilə kəmiyyəti müəyyən edilir.SİM-XL proqramından istifadə etməklə əldə edilmiş spektrlərdən çarpaz bağlı peptidlər müəyyən edilmiş və ayrı-ayrı birləşmələr xQuest28 və SIM-XL29 açıq mənbəli hesablama proqram boru kəmərlərindən istifadə etməklə kompleks şəbəkəyə birləşdirilmişdir (şək. 2).SIM-XL sadə və ya mürəkkəb zülal qarışıqlarında zülal-zülal qarşılıqlı təsirini, daxili zəncirləri və fərdi zəncirləri müəyyən edir və zülal strukturlarında qarşılıqlı təsirlərin vizuallaşdırılması üçün skriptlər təqdim edir.Bundan əlavə, o, hər bir çarpaz istinadı MS/MS29 spektrinin keyfiyyətinə uyğun olaraq ID balı kimi sıralayır.Bir neçə yüksək etibarlı zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi və kompleksləri müəyyən edilmiş və molekulyar dinamikanın (MD) modelləşdirilməsindən istifadə etməklə komplekslərin ko-immunopresipitasiyası və konformasiya dəyişikliklərindən istifadə etməklə yeni qarşılıqlı əlaqə daha sonra tədqiq edilmişdir (şək. 2) 30, 31.
CLMS metodunun sxematik icmalı.Flo-1 hüceyrələri 24 saat ərzində 10 ng/ml IFNα ilə müalicə olundu, ardınca DSS-dən istifadə edərək in situ protein çarpaz bağlandı, ardınca hüceyrə lizisi və tripsinizasiyası aparıldı.Çarpaz əlaqəli nümunələr Orbitrap kütlə spektrometrindən istifadə edərək təhlil edildi və LC-MS/MS zamanı peptid prekursorlarının parçalanması üçün daha sonra nümunə götürüldü.Çapraz bağlı peptidlərin (SIM-XL) spektrinin tanınması maşınının köməyi ilə əldə edilmiş spektrlərdən iki əlaqəli peptid müəyyən edildi və bütün birləşmələr hesablama boru kəmərlərindən istifadə edərək kompleks şəbəkəyə birləşdirildi.Yanlış müsbət nisbət (FDR) balları əsasında aşağı inamlı qarşılıqlı əlaqəni süzün.Bir neçə yeni yüksək sədaqətli zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi ko-immunoprecipitation istifadə edərək daha da təsdiqləndi və komplekslərdəki konformasiya dəyişiklikləri molekulyar dinamikanın (MD) modelləşdirilməsindən istifadə edərək araşdırıldı.
Cəmi ~30,500 və ~28,500 peptidlər, stimullaşdırılmamış və stimullaşdırılmış IFNα nümunələrində MaxQuant istifadə edərək aşkar edilmişdir (Əlavə Cədvəl S1, Şəkil 3A).Hər iki halda peptid uzunluğu paylanması çarpaz bağlı peptidlərin mövcudluğunu göstərən daha böyük peptidlərin daha yüksək nisbətini göstərdi (Şəkil 3B, C).Bundan əlavə, IFNα ilə müalicə olunan nümunələrdə 40-55 diapazonunda daha böyük peptidlərin böyük bir hissəsi mövcud idi (Şəkil 3C).Log2 intensivliyinə qarşı zülal xəritələşdirilməsi göstərdi ki, klassik interferonla stimullaşdırılan zülallar MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 və HLA-F (Şəkil 3D) daxil olmaqla, müalicə olunmamış nümunələrlə müqayisədə ən bol olub.Reactome yolu məlumat bazasından istifadə edərək IFNα müalicəsinə cavab olaraq üç dəfədən çox zənginləşdirilmiş zülallar üçün yolların təhlili göstərdi ki, MHC-I-vasitəçiliyi ilə antigenin təqdim edilməsi və işlənməsi ən dominant yoldur (Şəkil 3E).Əvvəlki hesabatlara uyğun olaraq, OAS və ISG15, həmçinin IFNα/β və sitokin siqnalı ilə vasitəçilik edilən antiviral cavablar aktivləşdirilmiş yollar arasında idi.Bundan əlavə, SIM-XL istifadə edərək ilkin əldə edilmiş MS/MS spektrlərindən lizin və serin spesifik protein çarpaz əlaqələri müəyyən edilmişdir.Son bir araşdırma, 5 hüceyrə tipində fərdi ISG həddindən artıq ekspressiya tədqiqatlarının meta-analizi ilə 9 virus sinfindən 20 virusu əhatə edən 104 ISG-nin məlumatını verdi9.Bununla belə, böyük məlumat dəstlərinin skrininqinin hesablama məhdudiyyətlərini aradan qaldırmaq üçün biz Padaria və digərləri tərəfindən bildirilən IRDS genlərinin siyahısı arasında mümkün qarşılıqlı əlaqəni araşdırmaq üçün daha kiçik verilənlər toplusu ilə başladıq, əksəriyyəti ISG-lərdir.
IFNa-ya cavab olaraq diferensial şəkildə ifadə edilmiş çarpaz bağlı zülalların müəyyən edilməsi (MaxQuant-dan əldə edilən məlumatlar).(A) IFNα14 ilə işlənmiş və müalicə olunmamış Flo-1 nümunələrində müəyyən edilmiş ümumi və eksklüziv peptidlərin sayını əks etdirən Venn diaqramı.Təmizlənməmiş (B) və IFNα ilə işlənmiş (C) çapraz bağlanmış nümunələrin peptid uzunluğu paylanması.(D) Təmizlənməmiş və IFNα14 ilə işlənmiş Flo-1 hüceyrələri arasında log2 (LFQ intensivliyi) təmsil edən istilik xəritəsi.Sol panel IFNα-nın iştirakı ilə ən aktiv şəkildə aktivləşdirilmiş zülalları göstərir.(E) IFNa ilə müalicədən sonra 20 əsas zənginləşdirmə yolunu təmsil edən histoqram.Reactome yolu məlumat bazası tənzimlənən IFNα-ya cavab verən zülallarda dörd dəfədən çox dəyişiklikləri təhlil etdi.
İnterferon vasitəçiliyi ilə ISG stimullaşdırılması yaxşı sənədləşdirilmişdir, lakin molekulyar səviyyədə bu zülalların geniş bioloji funksiyalarla necə başa çatması zəif başa düşülür.Maraqlıdır ki, biz MX1, USP18, ROBO1, OAS3 və STAT1 zülalları daxil olmaqla, IFNα müalicəsinə cavab olaraq böyük bir kompleks meydana gətirən bir şəbəkə müəyyən etdik (Şəkil 4, Cədvəl S2) 32,33,34.Ən əsası, bu qarşılıqlı təsirlər IFNa ilə müalicə olunan bütün üçlüklərdə tapıldı və müalicə olunmamış nümunələrdə tapılmadı, bu da onların xüsusi olaraq IFNa ilə müalicəyə cavab olaraq formalaşdığını göstərir.Məlumdur ki, STAT1 transkripsiya ilə bu ISG-lərin ifadəsini tənzimləyir, lakin onun protein səviyyəsində ISG-lərlə qarşılıqlı əlaqəsi öyrənilməmişdir.STAT1-in kristal quruluşu göstərdi ki, onun spiral sahəsi (CCD) dimerlərin formalaşması zamanı DNT və ya protomerlərlə qarşılıqlı təsirdə iştirak etmir35.Bu α-sarmallar qarşılıqlı təsirlərin baş verməsi üçün əsasən hidrofilik səth sahəsini təmin edən spiral spiral strukturu əmələ gətirir 35 .CLMS məlumatlarımızda biz müşahidə etdik ki, STAT1 ilə qarşılıqlı əlaqənin əksəriyyəti CCD-dən, bağlayıcı domendən və ya C-terminal quyruğundan (qalıqlar 700-708) əvvəlki SH2 domenində baş verib (Şəkil 4A).Əvvəlki bir araşdırma, USP18-in STAT2-nin CCD və DNT bağlayan domeninə (DBD) bağlandığını və tip I interferon siqnalının inhibe edilməsinə vasitəçilik etmək üçün I tip interferon reseptor IFNAR2-nin alt bölməsinə cəlb edildiyini bildirdi 24 .Məlumatlarımız həmçinin USP18 katalitik domeninin STAT1 DBD ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu göstərdi (Şəkil 4A,D), həm STAT1, həm də STAT2-nin USP18-in IFNAR2-yə cəlb edilməsində rol oynaya biləcəyini göstərir.
(A) Zülal-zülal qarşılıqlı təsirini göstərən 2D qarşılıqlı əlaqə planı (SIM-XL proqramında yaradılıb), molekullararası qarşılıqlı əlaqəni təmsil edən xətlərlə (çarpaz əlaqə kəsimi 3.5-ə təyin edilmişdir).Domain ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678-758) və fn3 (777-864).STAT1 sahələri: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) və STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Çapraz bağlı zülalların (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 və STAT1) dairəvi görüntüləyicisi, müvafiq olaraq mavi və qırmızı ilə işarələnmiş qarşılıqlı təsirlər və qarşılıqlı təsirlər.Çarpaz keçid həddi 3,5 olaraq təyin edildi.Nöqtə qrafikləri MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) və OAS3 (F) ilə STAT1 qarşılıqlı təsir sahələrini, eləcə də iki peptid arasında K və ya S qarşılıqlı təsir sahələrini göstərir.Şəkildə, çarpaz keçid bal həddi 3.0 olaraq təyin edilmişdir.(G) STAT1 və OAS3 DI domenləri arasında PyMol-da onların zülal strukturlarına əlavə edilmiş müxtəlif qarşılıqlı təsir saytları (PyMOL molekulyar qrafika sistemi, versiya 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) və OAS3 (pdb id: 4s3n34).) proqramı.
İnsanlarda USP18-in iki izoforması təsvir edilmişdir, əsasən nüvədə yerləşən tam uzunluqlu bir zülal və N-terminal sahəsi olmayan bir izoform, USP18-sf, sitoplazmada və nüvədə bərabər paylanmışdır 36 .Bundan əlavə, N-terminusun strukturlaşdırılmadığı və izopeptidaza aktivliyi və ya ISG1537 bağlanmasını tələb etmir.Tədqiqatımızda müəyyən edilən qarşılıqlı təsirlərin əksəriyyəti zülalın N-terminusunda yerləşirdi və bu qarşılıqlı təsirlərin tam uzunluqlu USP18 (Şəkil 4A, D) ilə əlaqəli olduğunu və beləliklə, nüvədə baş verdiyini göstərir.Üstəlik, məlumatlarımız N-terminusun zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi üçün ixtisaslaşmış olduğunu göstərir.IFNAR2 bağlanma yeri 312-368 qalıqları arasında yerləşir və xüsusilə kompleksdəki zülalların heç biri bu bölgəyə bağlanmır (Şəkil 4A) 37,38.Birlikdə götürülmüş bu məlumatlar göstərir ki, IFNAR2 bağlayıcı domen yalnız reseptor zülalı tərəfindən istifadə olunur.Bundan əlavə, yalnız OAS3 və ROBO1-in N-terminus və IFNAR2 bağlama sahəsinin yuxarı hissəsindəki domenlərlə əlaqəli olduğu aşkar edilmişdir (Şəkil 4A).
ROBO1 transmembran siqnal molekullarının immunoqlobulin (Ig) super ailəsinə aiddir və hüceyrədənkənar bölgədə beş Ig domenindən və üç fibronektin (Fn) domenindən ibarətdir.Bu hüceyrədənkənar domenlərin ardınca membran-proksimal bölgə və tək transmembran spiral 39. Strukturlaşdırılmamış hüceyrədaxili bölgə C-terminusunda yerləşir və effektor zülal bağlanmasına vasitəçilik edən konservləşdirilmiş ardıcıl motivləri ehtiva edir39.Amin turşularından ~1100-dən 1600-ə qədər uzanan bölgə əsasən nizamsızdır.Biz tapdıq ki, MX1 ROBO1 ilə Ig, Fn və hüceyrədaxili domenlər vasitəsilə qarşılıqlı təsir göstərir, halbuki STAT1 ilə ən çox qarşılıqlı əlaqə onun CCD, bağlayıcı domen və ROBO1-in C-terminusu arasında baş verir (Şəkil 4A,E).Digər tərəfdən, DI, DIII və OAS3 bağlayıcı bölgələri ilə qarşılıqlı əlaqə ROBO1 zülalı boyunca paylanmışdır (Şəkil 4A).
Oliqoadenilat sintaza (OAS) zülal ailəsi hüceyrədaxili ikizəncirli RNT-ni (dsRNT) qəbul edir və bağlayır, konformasiya dəyişikliklərinə məruz qalır və 2′,5′-ə bağlı oliqoadenilatları (2-5 As) sintez edir 40 .Müəyyən edilmişdir ki, üç OAS arasında OAS3 dsRNA-ya ən yüksək yaxınlıq nümayiş etdirir və RNase L-ni aktivləşdirə bilən və bununla da viral replikasiyanı məhdudlaşdıra bilən ən az 2-5 As miqdarını sintez edir 41 .OAS ailəsi polimeraza beta (pol-β) kimi nukleotid transferaz domenlərindən ibarətdir.Əvvəlki tədqiqatlar göstərdi ki, C-terminal domeninin (DIII) katalitik aktivliyi OAS342-nin aktivləşdirilməsi üçün tələb olunan dsRNA bağlayan domendən (DI) asılıdır.OAS3-ün DI və DII domenlərinin CCD və SH2 və STAT1 TAD arasında kiçik bir birləşmə bölgəsi ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu müşahidə etdik (Şəkil 4A, F).Zülal strukturunda müxtəlif çarpaz əlaqə saytlarının üst-üstə düşməsi β-vərəq və DBD STAT1 döngəsi və OAS3-ün DI domenində 60-75 qalıqları tərəfindən əmələ gələn açıq cib və ya boşluq arasında qarşılıqlı əlaqəni aşkar etdi (Şəkil 4G).Kompleksdəki zülalların oriyentasiyası da göstərdi ki, OAS3 ilə qarşılıqlı təsirlərin heç biri onun DI domeninin DNT-ni bağlama qabiliyyətinə mane olmur (Şəkil S1A).Bundan əlavə, GTPase MX1-in N-terminal sahəsi OAS3-ün DI və DIII domenləri ilə geniş şəkildə qarşılıqlı əlaqədə olur (Şəkil 4A).Biz həmçinin IFNα ilə müalicə olunan hər üç təkrarda OAS1 və MX1 arasında qarşılıqlı əlaqəni müşahidə etdik, burada tək bir OAS1 domeni (həmçinin katalitik olaraq aktiv) hər üç MX1 domeni ilə qarşılıqlı əlaqədə idi (Şəkil S2A, B).
MX zülalları, GTP-ni bağlayan və hidroliz edən N-terminal GTPaz domenini, öz-özünə yığılmada vasitəçilik edən ara domenini və GTPaz (LZ) kimi çıxış edən C-terminal lösin fermuarı ehtiva edən böyük dineyinə bənzər GTPazlar ailəsinin bir hissəsidir. ).domen effekti domeni25,43.MX1 viral genin transkripsiyasını bloklamaq üçün viral polimerazaların alt bölmələrinə bağlanır43.Daha əvvəl bildirilmiş iki hibrid maya ekranı göstərdi ki, PIAS1 ilə əlaqəli MX1 DNT-ni bağlama fəaliyyətini bloklayaraq STAT1-vasitəçili gen aktivləşməsini maneə törədir və həmçinin SUMO E344,45 liqaz aktivliyinə malikdir.Burada MX1-in STAT1-ə bağlandığını nümayiş etdiririk (Şəkil 4C,D), lakin bu qarşılıqlı əlaqənin IFNα-ya cavab olaraq STAT1-vasitəçili gen aktivasiyasına necə təsir etdiyini daha çox öyrənməyə ehtiyac var.Bundan əlavə, MX1-in IFNα ilə müalicə olunan hər üç təkrarda IFIT3 və DDX60 ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu aşkar etdik (Şəkil S2C).
DDX60, əvvəllər viral RNA46-nın RIG-I-dən asılı olmayan deqradasiyasında rol oynadığı bildirilmiş IFN-induksiya etdiyi sitoplazmik helikazdır.O, RIG-I ilə qarşılıqlı əlaqədə olur və onun siqnalını liqand-spesifik şəkildə aktivləşdirir 46. DDX60 viral RNT və DNA47-ni bağlayan DEXD/H-Box helikaz domenindən və C-terminal helikaz domenindən ibarətdir.Onun MX1 və IFIT3 ilə qarşılıqlı əlaqəsinin əksəriyyəti kanonik domenlər və ya motivlər olmayan uzun N- və C-terminal bölgələrində baş verir (Şəkil S2E,F).IFIT ailəsinin zülallarında tetrapeptid təkrarı (TPR) adlanan fərqli spiral-dönmə spiral motivinin tandem nüsxələri var.Birlikdə götürdükdə, məlumatlarımız göstərir ki, IFIT3 və DDX60 əsasən IFIT3-ün TPR 3-6 arasındakı bölgədə qarşılıqlı təsir göstərir və RIG-I/MAVS siqnalında rol oynaya bilər (Şəkil S2F).
Bütün proteomun skrininqinin hesablama baxımından intensiv olduğunu nəzərə alsaq, sonra biz bütün insan UniProt verilənlər bazasını IFNα ilə müalicə olunan təkrarlardan birinin olması üçün yoxladıq.MS/MS spektrləri ilə müəyyən edilmiş zülal yollarının təhlili göstərdi ki, MHC-I əsaslı antigenin işlənməsi və təqdim edilməsi interferon tərəfindən törədilən əsas yoldur (Şəkil 3D).Buna görə də, biz bütün çarpaz bağlı nümunələrdə yüksək dərəcədə inamla MHC-I molekullarının zülal qarşılıqlı təsirlərini öyrənməyə diqqət yetirdik.HLA α1, α2 və α3 domenlərindən və yüngül zəncirlərdən ibarətdir və mikroqlobulin β2 (β2m) daimi şaperon proteinidir49.Endoplazmatik retikulumda yığıldıqdan sonra HLA peptid liqandları olmadıqda qeyri-sabitdir50.Peptid bağlayan yiv qeyri-peptid formada yüksək polimorfik və strukturlaşdırılmamış α1 və α2 domenləri və nisbətən az polimorfik α351 domenindən əmələ gəlir.IFNα varlığında biz iki HLA-A kompleksi aşkar etdik: biri HMGA1 və H2B (Şəkil 5, Cədvəl S3), digəri isə MDN1, LRCH4 və H2B ilə qarşılıqlı əlaqədə olur (Şəkil 6).
IFNα H2B (H2BFS) və HMGA1 ilə HLA-A qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsini yaradır.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksində qarşılıqlı əlaqənin müxtəlif növlərini təsvir edən 2D plan (SIM-XL proqramında yaradılıb): interlink (mavi), interlink (qırmızı) və tək link (qara)..Fərqli identifikasiyalı domenlər rənglə kodlanır32: H2B (histon; 2-102) və MHC-I (MHC_1; 25-203, qrup C1; 210-290 və MHC_I_C; 337-364).Çarpaz keçid həddi 3,5 olaraq təyin edildi.Nöqtə qrafikləri H2B (B) və HMGA1 (C) ilə HLA-A qarşılıqlı təsir sahələrini, həmçinin iki peptid arasında K və ya S qarşılıqlı təsir sahələrini göstərir.Şəkildə, çarpaz keçid bal həddi 3.0 olaraq təyin edilmişdir.(D) PyMOL proqramında H2B, HLA-A və HMGA1 zülallarının strukturlarında göstərilən zülallar arasındakı əlaqələr.Bu strukturlar Phyre2 serverindən (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) istifadə edilməklə modelləşdirilmişdir və H2B, HLA-A və HMGA1 zülalları üçün şablon strukturlar müvafiq olaraq 1kx552, 1kj349 və 2eze55 olmuşdur.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 və LRCH4 ilə HLA-A qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsini yaradır.(A) 2D interaktiv xəritədə (SIM-XL proqram təminatında yaradılmış) təqdim olunmuş molekuldaxili (qırmızı) və molekullararası (mavi) çarpaz bağlantılar MDN1 ilə dairə şəklində təmsil olunur.Çarpaz keçid həddi 3,5 olaraq təyin edildi.Fərqli identifikasiyalı domenlər rəng kodludur32: H2B (histon; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, qrup C1; 210-290 və MHC_I_C; 337-364) və LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137-194) və CH (535-641)).Bu strukturlar H2B, HLA-A, LRCH4 və MDN1 zülalları üçün 1kx552, 1kj349, 6hlu62 və 6i2665 şablon strukturları ilə Phyre2 serverindən (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) istifadə edilərək modelləşdirilmişdir. müvafiq olaraq.
Histon H2B genomun bütövlüyünü qorumaqla yanaşı, transkripsiyanın tənzimlənməsində də iştirak edir.H2B zülalı ilgəklərlə ayrılmış üç α-spiral və C-terminal quyruğu 41,52 ilə əmələ gələn mərkəzi histon domenindən (HFD) ibarətdir.H2B ilə qarşılıqlı əlaqənin çox hissəsi HFD heterodimeri ilə trimerizasiyanı təmin edən α1 sarmalında baş verir (Şəkil 5A,B).Lizinlər DNT-nin bağlanmasında iştirak etsə də, bəzi lizinlər də alternativ asetilləşmə və ya metilasiya sahələridir.Məsələn, H2B-dən olan K43, K46 və K57 qalıqları birbaşa DNT-nin bağlanmasında iştirak etmir, lakin müxtəlif post-transkripsiya modifikasiyalarının hədəfidir53.Eynilə, H2B-də K44, K47 və K57 qalıqları IFNα-nın mövcudluğunda, o cümlədən digər zülallarla qarşılıqlı əlaqədə alternativ rol oynaya bilər (Şəkil 5A, B).Bundan əlavə, ekstraxromosomal histon H2B müxtəlif hüceyrə tiplərində immun cavabını aktivləşdirir, yoluxucu agentlərdən və ya zədələnmiş hüceyrələrdən əldə edilən cüt zəncirli DNT (dsDNA) fraqmentlərini aşkar etmək üçün sitozolik sensor kimi fəaliyyət göstərir54.DNT viruslarının mövcudluğunda, H2B tükənməsi IFN-β istehsalını və STAT154 fosforlaşmasını maneə törədir.H2B həmçinin digər əsas histonlardan daha sürətli nüvəyə daxil olub ondan çıxdığı bilinir54.MDN1 və LRCH4 ilə H2B qarşılıqlı əlaqəsi seçilmiş təmizlənməmiş nümunələrdə də müşahidə edilmişdir.HLA-A-nın H2B ilə hər üç IFNα ilə müalicə olunan nümunədə və bir müalicə olunmamış təkrar nümunədə qarşılıqlı təsir göstərdiyini aşkar etdik.Bu məlumatlar H2B-nin transkripsiya tənzimlənməsindən asılı olmayaraq alternativ fizioloji funksiyada rolunu əks etdirir.
Xəstəliyi təşviq edən amin turşuları ilə zəngin olan kiçik bir nukleoprotein olan HMGA1 (yüksək hərəkətlilik qrupu AT-Hook 1), HLA-A ilə birlikdə müəyyən edilmişdir.Turşu C-terminal quyruğu və AT qarmaqları adlanan üç fərqli DBD var, çünki onlar dsDNA55,56-da AT ilə zəngin bölgənin kiçik yivinə bağlanırlar.Bu bağlama DNT-nin əyilməsinə və ya düzəlməsinə səbəb olur, bu da kanonik transkripsiya faktorlarının konsensus ardıcıllığına daxil olmasına imkan verir.C-terminal quyruğunun zülal-zülal qarşılıqlı təsirində və transkripsiya faktorlarının cəlb edilməsində iştirak etdiyi güman edilir, çünki C-terminal delesiya mutantları transkripsiyaya başlaya bilmir57.Bundan əlavə, bu domen kinazlar üçün məlum substratlar olan bir neçə qorunmuş fosforlaşma sahələrini ehtiva edir 58 .Biz C-terminal domenindən kənarda HMGA1 ilə HLA-A və H2B qarşılıqlı əlaqəsini müşahidə etdik, C-terminal domeninin əsasən transkripsiya faktorunun bağlanması üçün istifadə edildiyini irəli sürdük (Şəkil 5A, C).HMGA zülalları adapter DNT-yə bağlanmaq üçün histon H1 ilə rəqabət aparır və bununla da əlçatanlığı artırır57.Eynilə, HMGA-nın histon H1 ilə rəqabətdə bağlayıcı DNT boyunca histon H2B ilə qarşılıqlı əlaqədə olması ehtimalı var.HMGB1 dendritik hüceyrələrdə HLA-A, -B və -C ifadəsini induksiya edir, onların aktivləşməsinə gətirib çıxarır59, lakin HMG və HLA arasında qarşılıqlı əlaqə əvvəllər bildirilməmişdir.HMGA1-in HLA-A-nın α1 və α3 domenləri ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu, qarşılıqlı təsirlərin əksəriyyətinin 3 DBD-dən kənarda olduğunu aşkar etdik (Şəkil 5A,C).Bizim əlimizdə HLA-A-nın nüvədə lokallaşdırıldığı aşkar edildi (məlumatlar göstərilmir) və H2B və HMGA1-in də nüvədə mövcud olduğunu nəzərə alsaq, bu qarşılıqlı təsir çox güman ki, nüvədə baş verir.H2B, HLA-A və HMGA1 arasında ölçülən xüsusi əlavələr Şəkil 5D-də göstərilmişdir.
HLA-A-nın digər zülallarla ən çox qarşılıqlı əlaqəsi onun α1 və α2 domenlərində və nizamsız C-terminal domenində baş verir (Şəkil 6).Bu nümunələrdən birində HLA-A-nın LRCH4-ün nizamsız N-terminal quyruğu ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu gördük (Şəkil 6A,D).LRCH4 TLR4 aktivasiyasını və LPS sitokin induksiyasını tənzimləyir, bununla da fitri immun cavabı modulyasiya edir60,61.Bu, ektodomenində doqquz lösinlə zəngin təkrar (LRR) və kalmodulin (CH) homoloji motivi olan membran zülalıdır, ardınca transmembran sahəsi (TMD) 60, 62.CH domenlərinin zülal-protein qarşılıqlı təsirinə vasitəçilik etdiyi bildirilmişdir 60 .LRR və CH domenləri arasında təxminən 300 amin turşusunun uzanması nisbətən əlçatandır, lakin nizamsızdır.Zülal-zülal şəbəkələrinin və vezikulyar daşınmanın vasitəçiləri kimi pozulmuş bölgələrin funksiyasına əsaslanaraq 63, zülalların qarşılıqlı təsirlərinin əksəriyyətinin pozulmuş bölgələrdə baş verdiyini aşkar etdik.MDN1 ilə qarşılıqlı əlaqə LRR1, LRR6, CH domenləri və təsadüfi bölgələr daxil olmaqla zülalın uzunluğu boyunca paylanmışdır, H2B isə əsasən CH sahəsinə bağlıdır (Şəkil 6A, B).Qeyd edək ki, qarşılıqlı təsirlərin heç biri TMJ-ni əhatə etmir, bu da CLMS yanaşmasının spesifikliyini göstərir (Şəkil 6A, B).
AAA zülal ailəsinə aiddir (müxtəlif fəaliyyətlərlə əlaqəli ATPazlar).Bu, heksamerik halqaya çevrilən və 60S 64 ribosomal alt bölməsindən montaj faktorunu çıxaran eyni N-terminal AAA sahəsidir.dynein64,65,66-ya bənzəyir.Bundan əlavə, Asp/Glu ilə zəngin bölgəni MIDAS domeni (metal ionundan asılı sahə) izləyir.MDN1-in böyük ölçüləri (təxminən 5600 amin turşusu) və yaxşı öyrənilmiş zülallarla məhdud homologiyası səbəbindən onun strukturu və insanlarda funksiyası haqqında çox az şey məlumdur.Biz HLA-A, H2B və LRCH4-ü MDN1 bağlayıcı tərəfdaşlar kimi müəyyən etdik və onların oriyentasiyasını PyMol-da protein kompleksləri kimi aşkar etdik (Şəkil 6A,B).Bu üç zülal AAA domeni, dinəbənzər bağlayıcı domen və bəlkə də MIDAS MDN1 domeni ilə qarşılıqlı əlaqədə olur.Əvvəlki hesabatda, yem zülallarının yaxınlıq təmizliyi MDN1-i histon H2B67 ilə əlaqəli bir protein kimi müəyyən etdi.Bundan əlavə, bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma, yaxınlıqdan təmizlənmiş kütlə spektrometriyasından istifadə edərək HCT116 hüceyrələrində MDN və HLA-B arasında qarşılıqlı əlaqənin olduğunu bildirdi, bu da tapıntılarımızı dəstəklədi68.IFNα ilə müalicə olunan nümunələrdə bu kompleksin müəyyən edilməsi MDN1-in interferon siqnalında rolunu göstərir.
HLA genləri yüksək polimorfik olduğundan, biz Flo-1 hüceyrələrinin RNT sıralama məlumatlarından HLA-A, -B və -C xəritələrini əks etdirən ardıcıllıq oxunuşlarını çıxardıq (məlumatlar göstərilmir).Ardıcıllığın oxunmasına uyğun peptid ardıcıllığı HLA-A-da çarpaz bağlı peptidlərin yerləşdiyi bölgələrdə HLA-A, -B və -C arasında əhəmiyyətli fərqlər aşkar etdi (Şəkil S3).Bundan əlavə, HLA-B/C molekullarının H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 zülalları ilə zülal-protein çarpaz əlaqəsini müşahidə etmədik.Bu, HLA-A, MDN1, LRCH1 və HMGA1 arasında aşkar edilən zülal qarşılıqlılığının HLA-A spesifik olduğunu göstərir.Bundan əlavə, çarpaz bağlanmamış nümunələrin proteomik təhlili (Cədvəl S4) göstərdi ki, HLA-A HLA-B və ya HLA-C ilə müqayisədə daha yüksək ardıcıllığa malikdir.HLA-A üçün müəyyən edilmiş peptidlər həm IFNa ilə işlənmiş, həm də təmizlənməmiş nümunələrdə yüksək intensivliyə malik olmuşdur.
Burada müəyyən edilmiş qarşılıqlı təsirlərin yaxın məkanda iki zülalın qeyri-spesifik çarpaz əlaqəsi ilə bağlı olmadığından əmin olmaq üçün biz birgə immunopresipitasiya analizlərini həyata keçirməklə iki yeni HLA-A qarşılıqlı təsir faktorunu daha da təsdiq etdik.HLA-A-nın endogen MDN1 və H2B ilə qarşılıqlı təsiri həm IFNα ilə müalicə olunmuş, həm də müalicə olunmamış Flo-1 hüceyrələrində aşkar edilmişdir (Şəkil 7, Şəkil S4).HLA-A-nın immunopresipitatlarda H2B tərəfindən tutulduğunu və bu əlaqənin IFNα müalicəsi ilə bağlı olduğunu təsdiq etdik, çünki HLA-A təmizlənməmiş hüceyrələrdən alınan immunopresipitat nümunələrində yoxdur (Şəkil 7A).Bununla belə, məlumatlarımız IFNα-nın HLA-A-nın H2B və MDN1-ə bağlanmasını diferensial şəkildə tənzimlədiyini göstərir.IFNα H2B və HLA-A arasında əlaqə yaradır, lakin onun MDN1 ilə əlaqəsini azaldır.Biz MDN1-in nəzarətdə HLA-A ilə əlaqəli olduğunu və IFNα-nın əlavə edilməsinin IFNα tərəfindən MDN1 induksiyasından asılı olmayaraq bu qarşılıqlı əlaqəni azaltdığını aşkar etdik (Şəkil 7B,C).Bundan əlavə, HLA-A immunoprecipitation A549 hüceyrələrində H2B tutdu (Şəkil S4), bu qarşılıqlı əlaqənin hüceyrə tipindən asılı olmadığını göstərir.Birlikdə götürüldükdə, bu nəticələr HLA-A-nın H2B və MDN1 ilə interferon vasitəçiliyi ilə qarşılıqlı təsirini dəstəkləyir.
HLA-A H2B və MDN1-i birgə təmizləyir.Nümayəndə endogen H2B (A) və MDN1 (B) immunoblotları IFNα ilə müalicə olunmuş Flo-1 hüceyrələrindən immunopresipitalanıb və göstərilən antikorlar üçün yoxlanılıb.Siçan və dovşan IgG mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir.(C) Müxtəlif antigenlərin nisbi miqdarı (girişi) göstərilən antikorlara qarşı yoxlanılmış immunoblotlar tərəfindən təsvir edilmişdir, β-aktin yükləmə nəzarəti kimi istifadə edilmişdir.
Bu kompleksdə iştirak edən zülalların konformasiya dinamikasını anlamaq üçün alternativ yanaşma kimi molekulyar dinamikanın modelləşdirilməsindən istifadə etdik (Şəkil 8).CLMS məlumatlarından əldə edilən nəticələr H2B, HLA-A və HMGA1 zülallarının müxtəlif konformasiyalarının mümkünlüyünü göstərir.MOE (Molekulyar Əməliyyat Mühiti; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Kvebek, Kanada) paketindən istifadə edərək ilkin zülal-zülal dok ekranı bu zülallar arasında fərqlənən mümkün uyğunlaşmaları təklif etdi (Şəkil 8A).Docking protein kompleksinin vizuallaşdırılması bir neçə qarşılıqlı əlaqə və mümkün uyğunlaşmaları aşkar etdi (Şəkil 5A, 8).Beləliklə, bir mümkün uyğunluq Şəkil 8A-da göstərilmişdir (etiketlənmiş çarpaz bağlantılarla) və o, MD modelləşdirmə boru kəmərindən istifadə etməklə daha da qiymətləndirilmişdir.Bundan əlavə, H2B və ya HMGA1-in HLA-A-ya bağlanması H2B-nin HLA-A-ya daha yüksək yaxınlığını vurğulayır (Şəkil 8A).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A və H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksləri arasında mümkün şəbəkələrin konformasiya dinamikası.(A) Sol panel molekuldaxili (qırmızı) və molekullararası (mavi) çarpaz bağlantıların 2D xəritəsidir (SIM-XL proqram təminatında yaradılmışdır) (çarpaz keçid kəsimi 3.5-ə təyin edilmişdir).Bundan əlavə, müəyyən edilmiş çarpaz bağlama qalıqları H2B, HLA-A və HMGA1 zülallarının strukturlarında etiketlənir.Bu zülalların əlaqəli konformasiyaları MOE paketində tətbiq olunan dok boru kəmərindən istifadə etməklə çıxarılmışdır.Aşağı sol panel H2B-HLA-A və HMGA1-HLA-A komplekslərinin müxtəlif zülal-zülal bağlama yaxınlıqları (GBVI/WSA dG; kkal/mol) ilə müxtəlif mümkün konformasiyalarını göstərir.(B) Hər bir zülal strukturu üçün atom yerlərinin (hidrogen atomları istisna olmaqla) standart sapması (RMSD).(C) Müddəti ≥ 10 ns olan spesifik qarşılıqlı təsirləri nəzərə alaraq müxtəlif simulyasiya edilmiş komplekslərdən molekullararası zülal-zülal hidrogen rabitəsi qarşılıqlı təsirləri.H bağının donor-akseptorunun kəsilmə məsafəsi 3.5 Å, donor-H-qəbuledicinin kəsilmə bucağı isə ≥ 160°-180° olaraq təyin edilmişdir.(D) HLA-A-H2B və HLA-A-HMGA1 komplekslərindən çıxarılan, ≥ 20 ns əhatə edən müvafiq partnyorları ilə HLA-A zülal-zülal qarşılıqlı təsirini yaradan etiketlənmiş qalıqlar.Zülal strukturları orta hesabla 100 ns MDS strukturunu təmsil edir.(E) HLA-A-H2B və HLA-A-HMGA1 kompleksləri arasında qarşılıqlı təsirlər, iki peptid arasında K və ya S qarşılıqlı təsir sahəsinə əsaslanaraq 100 ns-dən çox H2B-HLA simulyasiyası ilə izlənilən qarşılıqlı təsirlərlə müqayisədə.Komplekslər /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Çarpaz əlaqələrin qiymətləndirilməsi üçün hədd dəyəri 3.0 olaraq təyin edildi və MDS-dən ≥ 10 ns qəbul edən spesifik qarşılıqlı təsirlər nəzərə alındı.Zülal strukturları BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, ABŞ) və Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Monreal, Kvebek, Kanada) paketlərindən istifadə etməklə görüntülənib.
HLA-A molekullarının zamanla sabitliyi (standart sapma; RMSD və ya standart sapma; RMSF) komplekslərdə H2B və ya HMGA1 zülallarının mövcudluğunun HLA-A-nı sabitləşdirdiyini göstərdi (Şəkil 8B, Şəkil S5).HMGA1 zülalı HLA-A-nın B2M sahəsinə sıx şəkildə bağlanaraq HLA-A-HMGA1 və ya H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksində HLA-A amin turşularının sabitliyinə səbəb olur (Şəkil 8B, Şəkil S5).H2B və HMGA1 H2B-HLA-A-HMGA1 kompleksində HLA-A-nın tək H2B və ya HMGA1-ə bağlanması ilə müqayisədə HLA-A-ya daha yaxşı bağlanma göstərdi (Şəkil 8C,D; Cədvəl S5).Hidrogen bağlanmasında iştirak edən qalıqlar (MD modelləşdirilmiş yüksək yerlik ≥ 10 ns) kompleksdəki CLMS qarşılıqlı təsir sahələri (K və ya S qalıqları) ilə üst-üstə düşür və bu, CLMS tərəfindən müəyyən edilmiş qarşılıqlı təsirlərin çox etibarlı olduğunu göstərir.Etibarlılıq (Şəkil 8E ).CLMS və MD modelləşdirməsində təxminən 190-210 və təxminən 200-220 amin turşusu arasında olan HLA-A qalıqlarının müvafiq olaraq H2B və HMGA1-i bağladığı aşkar edilmişdir (Şəkil 8E).
Bir çox proteomik yanaşmalar zülalın ümumi sabit vəziyyət səviyyəsindəki dəyişiklikləri aşkar etdiyinə görə, zülal-zülal qarşılıqlı əlaqə dinamikası bağlama interfeyslərini tutmaq üçün əlavə alətlər tələb edir və CLMS belə alətlərdən biridir.İnterferon siqnal sistemi hüceyrələrə bir sıra ətraf mühitin patogen və daxili patoloji siqnallarına cavab verməyə imkan verən sitokin şəbəkəsidir və interferonla induksiya olunan zülalların alt dəstələrinin induksiyası ilə nəticələnir.İnterferon səbəb olduğu zülallar paneli arasında yeni zülal-zülal qarşılıqlı təsirlərinin müəyyən edilə biləcəyini müəyyən etmək üçün CLMS tətbiq etdik.Zülal komplekslərini tutmaq üçün interferona cavab verən Flo-1 hüceyrə modelində qlobal zülal çarpaz əlaqə analizindən istifadə edilmişdir.Çapraz bağlı olmayan və çarpaz bağlı hüceyrələrdən triptik peptidlərin çıxarılması peptidlərin hesablanmasına, yolun zənginləşdirilməsinə və müəyyən edilmiş LFQ intensivliyi ilə peptid uzunluğunun paylanmasına imkan verir.MX1, UP18, OAS3 və STAT1 kimi kanonik interferon-induksiya olunan zülalların yeni molekullararası və molekuldaxili çarpaz bağlı əlavələri müşahidə olunarkən, kanonik interferon-induksiya olunan zülallar müsbət daxili nəzarət kimi müəyyən edilib.Funksional sahələrdə müxtəlif struktur xüsusiyyətləri və qarşılıqlı əlaqələri araşdırılmışdır.
HLA-A, MDN1 və H2B arasında qarşılıqlı əlaqə IFNα ilə müalicə olunan və müalicə olunmayan Flo-1 və A549 hüceyrələrində immunoblotinq yolu ilə aşkar edilmişdir.Nəticələrimiz HLA-A-nın H2B ilə IFNα-dan asılı şəkildə kompleksləşdiyini vurğulayır.Bizim işimiz bu iki kompleksin birgə lokallaşdırılmasının gələcək tədqiqi üçün maraqlı bir yol təqdim edir.Hüceyrə tipindən asılı olmayan interferon vasitəçiliyi ilə zülal qarşılıqlı təsirlərini müəyyən etmək üçün CLMS yanaşmasını hüceyrə xətləri panelinə genişləndirmək də maraqlı olardı.Nəhayət, biz molekuldaxili və molekullararası çarpaz danışıqları izləyən H2BFS-HLA-A-HMGA1 kompleksində iştirak edən zülalların konformasiya dinamikasını anlamaq üçün alternativ yanaşma kimi MD modelləşdirməsindən istifadə etdik.CLMS məlumatlarından əldə edilən nəticələr H2BFS, HLA-A və HMGA1 zülallarının fərqli uyğunlaşmalarının mümkünlüyünü göstərir.Bu dok zülal kompleksləri arasında mümkün fərqli uyğunluqlar CLMS verilənlər bazasında müşahidə olunanlara bənzər bir neçə qarşılıqlı əlaqəni aşkar etdi.Metodumuzun əsas güclü tərəflərindən biri odur ki, o, HLA kimi qarşılıqlı təsirdə olan yüksək polimorfik genləri asanlıqla müəyyən etməyə imkan verir, ona görə də öyrənilməsi çətin olan HLA haplotipinə xas zülalların qarşılıqlı təsirlərini öyrənmək maraqlı olacaq.Birlikdə götürdükdə, məlumatlarımız göstərir ki, CLMS interferon-induksiya edilmiş siqnal şəbəkələri haqqında anlayışımızı genişləndirmək üçün istifadə edilə bilər və şiş mikromühitində daha mürəkkəb hüceyrələrarası sistemləri öyrənmək üçün əsas təmin edir.
Flo-1 hüceyrələri ATCC-dən alınmış və 1% penisilin/streptomisin (Invitrogen), 10% fetal iribuynuzlu zərdab (Gibco) ilə əlavə edilmiş və 37°C və 5% CO2-də saxlanılan DMEM-də (Gibco) saxlanılmışdır.İnkubasiya.Hüceyrələr IFNα14 (Edinburq Protein İstehsalı Müəssisəsi tərəfindən istehsal olunur) ilə müalicə edilməzdən əvvəl 70-80% birləşməyə qədər böyüdülür.Bütün digər kimyəvi maddələr və reagentlər başqa cür qeyd edilmədiyi təqdirdə Sigma Aldrich-dən alınmışdır.
Flo-1 hüceyrələri 6 quyu boşqablarda becərildi və ertəsi gün hüceyrələr təxminən 80% birləşmə ilə 24 saat ərzində 10 ng/ml IFNα14 ilə müalicə olundu.Hüceyrələr üç dəfə PBS ilə yuyuldu və 0,5 mM son konsentrasiyaya qədər 37 ° C-də 5 dəqiqə PBS-də təzə hazırlanmış DSS (Thermo Fisher Scientific) (DMSO-da həll edildi) ilə bağlandı.DSS çarpaz bağlama reaksiyası PBS ilə əvəz olundu və qalıq DSS 37°C-də 15 dəqiqə ərzində PBS-də 20 mM Tris (pH 8.0) əlavə edilərək söndürüldü.Hüceyrələr kazıma yolu ilə toplandı və aşağı bağlayıcı borulara (Aksigen) yığıldı.
Hüceyrə qranulları 300 µl sidik cövhəri lizis tamponu (8 M karbamid, 0,1 M Tris, pH 8,5) ilə otaq temperaturunda 30 dəqiqə ərzində ara-sıra silkələnmə ilə parçalandı.Bütün sentrifuqalama addımları 8°C-də 14.000 xg-da yerinə yetirildi.Lizatı 10 dəqiqə sentrifuqa edin və supernatantı yeni boruya köçürün.Qalan şəffaf hissəciklər 150 μl ikinci lizis tamponunda (2 M karbamid, 2% (ağırlıq/həc) SDS (natrium dodesil sulfat)) homojen sulu məhlul əldə olunana qədər 30 dəqiqə və ya daha çox müddətə həll edildi.Lizat 20 dəqiqə sentrifuqa edildi və supernatant əvvəlki mərhələdə əldə edilən lizatla qarışdırıldı.Protein konsentrasiyaları istehsalçının mikroplata prosedurları üçün təlimatlarına uyğun olaraq Micro BCA analizindən (Thermo Fisher Scientific) istifadə edilməklə qiymətləndirilmişdir.Nümunələr tez maye azotda donduruldu və -80°C-də saxlanıldı.
Wisniewski və digərləri tərəfindən təsvir edildiyi kimi, təxminən 100 μg həll olunan çarpaz bağlı zülal dəyişdirilmiş filtrasiya nümunəsi hazırlama protokolundan (FASP) istifadə edərək işlənmişdir.69 Qısaca, zülal 200 µl karbamid tamponu (0,1 M Tris-də 8 M karbamid, pH 8,5) ilə çarpaz bağlıdır, burulğalanır və yarıya bölünür.Bütün sentrifuqalama addımları 25°C-də 14000 xg-də yerinə yetirildi.Çarpaz bağlı zülal lizatının birinci yarısı Ultracel-10 membranı (Merck) ilə təchiz olunmuş 10 kDa-lıq Microcon mərkəzdənqaçma filtr cihazına köçürüldü, ardınca filtrdə 25 dəqiqə mərkəzdənqaçma aparıldı.Sonra zülalın ikinci yarısını filtrə əlavə edin və eyni addımları təkrarlayın.Zülalın bərpası karbamid tamponuna 100 μl 17 mM tris(2-karboksietil)fosfin hidroxlorid (TCEP) əlavə etməklə həyata keçirilmişdir.Qaytarma termomikserdə 600 rpm-də 30 dəqiqə 37°C-də qarışdırıldı.Bundan əlavə, sütun sentrifuqa edildi və azaldılmış çarpaz bağlı zülal karbamid tamponunda 100 μl 50 mM yodoasetamid istifadə edərək alkilləşdirildi.Alkilləşmə reaksiyası otaq temperaturunda 20 dəqiqə qaranlıqda aparıldı.Sütunu fırladın, sütun divarlarını 3 dəfə 100 µl karbamid tamponu ilə yuyun və sonra sentrifuqa edin.Eyni əməliyyat 100 μl 100 mM ammonium bikarbonatdan istifadə etməklə 3 dəfə aparılmışdır.Tripsinizasiyadan əvvəl toplama borusunu yenisi ilə əvəz edin.50 mM ammonium bikarbonat və tripsin tamponunda (Promega) seyreltilmiş 1 µl tripsin olan həzm tamponu əlavə edin.Tripsinin proteinə nisbəti təxminən 1:33 səviyyəsində saxlanıldı və həzm reaksiyaları bir gecədə 37 ° C-də nəm kamerada inkubasiya edildi.Çapraz bağlı peptid 25 dəqiqə sentrifuqa ilə filtrdən çıxarıldı.Peptidlərin bərpası filtrə 50 μl 0,5 M NaCl əlavə edilərək yaxşılaşdırıldı, ardınca 25 dəqiqə sentrifuqa edildi.
C18 Micro Spin sütunları (Harvard Aparatı) kiçik dəyişikliklərlə Bouchal et al.70 tərəfindən təsvir edilən protokola uyğun olaraq çarpaz bağlı triptik peptidləri duzsuzlaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir.Qısaca olaraq, C18 spin sütunları asetonitrildə (AcN) (Merck) 0,1% qarışqa turşusunun (FA) üç yuyulması və iki dəfə 0,1% FA yuyulması ilə aktivləşdirildi.Sütun 15 dəqiqə ərzində 0,1% FA ilə nəmləndirildi.Nümunələri spin sütunlarına yükləyin və 3 dəfə 0,1% FA ilə yuyun.Duzsuzlaşdırılmış peptidlər ardıcıl olaraq 0,1% FA-da 50%, 80% və 100% AcN istifadə edərək pilləli gradientlə elüt edilmişdir.Nümunələr SpeedVac Plus konsentratorunda (Eppendorf) qalıq maye tamamilə yox olana qədər qurudulmuşdur.Elüt edilmiş peptidlər 100 μl 0,08% trifluoroasetik turşuda 2,5% AcN-də həll edildi və konsentrasiyalar NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) ilə ölçüldü.LC-MS/MS sisteminə hər nümunə üçün təxminən 1 μg çarpaz bağlanmış peptid yeridildi.
Çarpaz bağlı peptidlər Orbitrap Exploris 480 kütlə spektrometrinə (Thermo Scientific) qoşulmuş UltiMate 3000 RSLCnano LC sistemində (Thermo Scientific) ayrıldı.Çarpaz bağlı peptidlər C18 PepMap100 sorbent və 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific) ilə dolu 300 µm ID, 5 mm uzunluğunda µ-sütunqabağı C18 tutma sütununda toplandı.2.5% AcN-də həll edilmiş 0.08% trifluoroasetik turşusu 5 µl/dəq ilə nasos axını dəstini yükləyin.Çarpaz bağlı peptidlər 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific) ilə doldurulmuş daxili diametri 75 μm və uzunluğu 150 mm olan analitik əridilmiş silisium sütununda ayrıldı.A və B mobil fazaları müvafiq olaraq suda 0,1% FA və asetonitrildə 0,1% FA-dan ibarət idi.Qradiyent 2.5% B-dən başlayır və xətti olaraq 90 dəqiqə ərzində 40% B-ə, sonra növbəti 2 dəqiqə ərzində 90% B-ə qədər artır.Mobil faza tərkibi 10 dəqiqə ərzində 90% B səviyyəsində saxlanıldı və sonra 2 dəqiqə ərzində xətti olaraq 2,5% B səviyyəsinə düşdü.Sütun növbəti dövrədən 8 dəqiqə əvvəl 2,5% B səviyyəsində tarazlaşdırıldı.Analitik sütundan çıxarılan çarpaz bağlı peptidlər nanoelektrosprey ionlaşma (NSI) mənbəyində ionlaşdırıldı və Exploris 480 kütlə spektrometrinə (Thermo Scientific) yeridildi.
Orbitrap Exploris 480 kütlə spektrometri müsbət məlumat korrelyasiya rejimində işləyirdi.Tam skan bölmə rejimində m/z 350 Th-dən m/z 2000 Th-ə qədər diapazon parametrləri ilə 120.000 qətnamə ilə həyata keçirilmişdir.Normallaşdırılmış AGC hədəfi maksimum 50 ms giriş vaxtı ilə 300% səviyyəsində müəyyən edilmişdir.Peptidlər üçün monoizotop pik aşkarlanması müəyyən edilmişdir.Həddindən artıq az prekursor aşkar edilərsə, məhdudiyyətin boşaldılması parametri doğru olaraq təyin edilir.Təcrübələrə prekursorun minimum ion gücü 5.0e3-ə təyin edilmiş və +8-ə qədər prekursor yük vəziyyətləri daxil edilmişdir.
Məlumat korrelyasiya rejimində əsas skanlar arasında dövr müddəti 2,5 saniyəyə təyin edilmişdir.Dinamik kütlənin xaric edilməsi prekursor ionunun ilk parçalanmasından sonra 20 saniyəyə təyin edildi.Öncül izolyasiya pəncərəsi 2 Th olaraq təyin edildi.Sabit toqquşma enerji rejimi ilə normallaşdırılmış toqquşma enerjisinin növü verilənlərdən asılı olan MS/MS taramasında seçilmişdir.Toqquşma enerjisi 30%-ə təyin edilib.Orbitrap qətnaməsi 15.000, AGC hədəfi isə 100% olaraq təyin edildi.Xüsusi maksimum inyeksiya vaxtı 60 millisaniyə olaraq təyin edilib.
Çarpaz bağlı nümunələrdə zülal-zülal şəbəkəsini izləməzdən əvvəl nümunələrdə izlənilə bilən peptidləri/zülalları müəyyən etmək üçün MaxQuant paketindən (versiya 1.6.12.0)26,27 istifadə edərək xam faylları emal etdik.Bundan əlavə, oxşar proteomik analizlər IFNα ilə müalicə edilmiş və müalicə olunmamış çapraz bağlanmamış Flo-1 nümunələri üzərində aparılmışdır.MS/MS məlumatları daxili Andromeda27 axtarış sistemindən istifadə etməklə UniProt insan bazasında (www.uniprot.org) (12 avqust 2020-ci ildə yüklənib, 75 093 girişdən ibarətdir) axtarılıb.Axtarış fermentin spesifikliyini və deamidləşmənin (N, Q) və oksidləşmənin (M) müxtəlif modifikasiyalarını göstərmədən aparılmışdır.Prekursorun kütlə toleransları 20 ppm və məhsul ionları 0,02 Da səviyyəsində müəyyən edilmişdir.İlkin və maksimum kütlə sapması 10 ppm olaraq təyin edildi.Peptidin maksimum kütləsi 4600 Da, ardıcıllıq oxşarlığı isə 7 ilə 25 amin turşusu (aa) arasında müəyyən edilmişdir.Əlavə statistik təhlil Perseus proqramından istifadə etməklə aparılmışdır (versiya 1.6.10.45).Protein tərkibi zülalın spektral intensivliyini normallaşdırmaqla (LFQ intensivliyi; etiketsiz kəmiyyət)27 hesablanmış və intensivlik dəyərləri Log2-yə çevrilmişdir.Peptid intensivliyi ilə müəyyən edilmiş zülalların iyerarxik qruplaşması R (v 4.1.2)-də pheatmap (v1.0.12) paketindən istifadə etməklə qurulmuşdur.Yolun zənginləşdirilməsi təhlili təmizlənməmiş nümunələrlə müqayisədə dörd dəfədən çox aktivləşdirilmiş IFNα ilə müalicə olunan zülallar üçün Reactome yol məlumat bazasından istifadə etməklə həyata keçirilmişdir.
LC-MS/MS tərəfindən monitorinq edilən zülal komplekslərinin lizin (K) və ya serin (S) spesifik kimyəvi çarpaz əlaqələrinin identifikasiyası çarpaz bağlı peptidlər (SIM-XL)29 üçün spektroskopik identifikasiya maşını (SIM-XL) istifadə edərək həyata keçirilmişdir.Birincisi, interferonla əlaqəli (IFN) DNT zədələnməsinə müqavimət imzası (IRDS) genləri arasında mümkün qarşılıqlı təsirlər Padariya və digərlərində təsvir edilən IRDS protein verilənlər bazasından istifadə edilərək araşdırıldı.Bütün insan UniProt-un bütün şərtlərinin və təkrarlarının skrininqi hesablama baxımından intensivdir, buna görə də bütün insan UniProt verilənlər bazası (www.uniprot.org) (12 avqust 2020-ci ildə endirilib, 75,093 girişdən ibarətdir) IFNα ilə müalicə olunan təkrarlara qarşı.Yüksək etibarlı qarşılıqlı əlaqə üçün filtrlərdən biri.Əldə edilən bu yüksək əhəmiyyətli qarşılıqlı əlaqələr genişləndirildi və bütün təkrarlarda və şərtlərdə sınaqdan keçirildi.
SIM-XL-də çarpaz bağlayıcı (XL) üçün DSS istifadə edilmişdir və XL çəkisinin dəyişməsi və modifikasiya çəkisinin dəyişməsi müvafiq olaraq 138.06 və 156.07-yə təyin edilmişdir.Aşağıdakı çarpaz əlaqə reaksiya sahələri nəzərə alınır: KK, KS və KN-TERM, reportyor ionları olmadan.Həm prekursor, həm də fraqment ppm 20, Xrea həddi isə 0,15 olaraq təyin edildi.Tripsin tamamilə spesifik hesab edildi və yüksək enerjili C-tələsi (HCD) parçalanma üsulu həyata keçirildi.XCorr dinamik DB azalma həddi və dinamik DB azaldılması üçün peptidlərin minimum sayı müvafiq olaraq 2,5 və 2 olaraq təyin edildi.Digər parametrlər bunlardır: monoizotop ehtimalı və pik təsadüf kəsimi, hər bir ipdə minimum 4 AA qalığı və maksimum tel yükü və buraxılmış parçalanmaların 3 maksimumu.Nəticədə tikilmiş 2D xəritələr (SIM-XL)-də təhlil edildi və 2D xəritələri yaratmaq üçün xQuest28 qrafik təsvirindən istifadə edildi.Zülal strukturları üzərində zülal keçidləri PyMol-da (PyMOL Molecular Graphics System, versiya 2.0 Schrödinger, LLC) təmin edilir.
Protein model strukturları Phyre2 serverindən (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 istifadə edilməklə, homoloji modelləşdirmə və “Gizli Markov Metodunun” həyata keçirilməsi prinsiplərindən istifadə etməklə yaradılmışdır.Phyre2 məlum zülal strukturları ilə ardıcıl uyğunlaşma əsasında model strukturları yaradır.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 və MDN1 zülalları üçün 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 və 6i2665 şablon strukturları istifadə edilmişdir.Bundan əlavə, AlphaFold71 MX1, UBP18 və ROBO1-in strukturu da nəzərdən keçirilib.Zülal strukturu BIOVIA Discovery Studio Visualizer paketi (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, ABŞ) və Molekulyar Əməliyyat Mühiti paketindən (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Kvebek, Kanada) istifadə edilməklə görüntülənib.