347 12.7*1.24mm Paslanmayan poladdan bükülmüş borular, Sinxron elektrostatik kondensasiyanın molekulyar mexanizmi və α-sinuklein və tau koaqreqasiyası

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.
Hər slaydda üç məqalə göstərən slayderlər.Slaydlar arasında hərəkət etmək üçün geri və sonrakı düymələrdən və ya hər slaydda hərəkət etmək üçün sonundakı slayd nəzarətçi düymələrindən istifadə edin.

347 Paslanmayan Polad Boru Spesifikasiyası

347 12.7*1.24mm Paslanmayan poladdan bükülmüş boru

Xarici diametri: 6.00 mm OD-dən 914.4 mm-ə qədər, Ölçülər 24” NB-ə qədər mövcuddur.

SS 347 Boru Qalınlığı Aralığı: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S və s. (0,5-12 mm) Və ya qeyri-müntəzəm ölçü tələb olunduğu kimi uyğunlaşdırılacaq

Növ: SS 347 Diksiz Borular |SS 347 ERW Boruları |SS 347 Qaynaqlı Borular |SS 347 Hazır borular |SS 347 CDW Boruları, LSAW Boruları / Dikişlə qaynaqlanmış / Yenidən çəkilmiş

Forma: SS 347 Dairəvi Borular/ Borular, SS 347 Kvadrat Borular/ Borular, SS 347 Düzbucaqlı Borular/ Borular, SS 347 Qıvrımlı Borular, SS 347 “U” Şekli, SS 347 Pan Kek Bobinləri, SS 347 Hidravlik Borular

Uzunluq: Tək təsadüfi, ikiqat təsadüfi və tələb olunan uzunluq ucu: düz uc, əyilmiş uc, dişli

Son Mühafizə: Plastik Qapaqlar |Xarici Finiş: Paslanmayan Polad Borular üçün 2B, №4, №1, №8 Güzgü Finişi, Müştərinin tələblərinə uyğun bitirmə

Çatdırılma Vəziyyəti: Tavlanmış və Turşu, Cilalanmış, Parlaq Tavlanmış, Soyuq Çəkilmiş

Təftiş, Sınaq Hesabatları: Dəyirman Sınaq Sertifikatları, EN 10204 3.1, Kimyəvi Hesabatlar, Mexaniki Hesabatlar, PMI Test Hesabatları, Vizual Təftiş Hesabatları, Üçüncü Şəxs Təftiş Hesabatları, NABL Təsdiqlənmiş Laboratoriya Hesabatları, Dağıdıcı Test Hesabatı, Dağıdıcı Sınaq Hesabatları

Qablaşdırma: Taxta qutulara, plastik torbalara, polad zolaqlara yığılmış və ya müştərilərin istəklərinə uyğun olaraq qablaşdırılır

Xüsusi xüsusiyyətlər: Yuxarıdakılardan başqa Ölçülər və Spesifikasiyalar sifariş əsasında hazırlana bilər

SS 347 Boru Ölçüsü Aralığı: 1/2 düym NB, OD - 24 düym

ASTM A312 347: Yüksək temperatur və ümumi aşındırıcı xidmət üçün nəzərdə tutulmuş tikişsiz və düz tikişli qaynaqlı ostenitik boru.Qaynaq zamanı metal doldurucuya icazə verilmir.

ASTM A358 347: Aşındırıcı və/və ya yüksək temperaturda xidmət üçün elektrik qaynaqlı östenitik boru.Tipik olaraq, bu spesifikasiyaya uyğun olaraq yalnız 8 düymədək boru istehsal olunur.Qaynaq zamanı doldurucu metalın əlavə edilməsinə icazə verilir.

ASTM A790 347: Ümumi korroziyaya qarşı xidmət üçün nəzərdə tutulmuş tikişsiz və düz tikişli qaynaqlı ferrit/austenit (dupleks) boru, stress korroziyasının çatlamasına qarşı müqavimətə xüsusi diqqət yetirilir.

ASTM A409 347: Düz tikişli və ya spiral tikişli elektrik qaynaqlı qaynaqlanmış böyük diametrli austenitik yüngül divar borusu 14 düymdən 30 düymədək olan divarları ilə Sch5S və Sch 10S aşındırıcı və/və ya yüksək

ASTM A376 347: Yüksək temperatur tətbiqləri üçün tikişsiz ostenitik boru.

ASTM A813 347: Yüksək temperatur və ümumi aşındırıcı tətbiqlər üçün tək tikişli, tək və ya ikiqat qaynaqlı ostenitik boru.

ASTM A814 347: Yüksək temperatur və ümumi aşındırıcı xidmət üçün soyuq işlənmiş qaynaqlı ostenitik boru.

347H Paslanmayan Polad Boruların Kimyəvi Tərkibi

Paslanmayan Polad 347H Boru Mexanik Xüsusiyyətləri

Paslanmayan Polad 347H Boruların Fiziki Xüsusiyyətləri

347H Paslanmayan Polad Boru üçün Ekvivalent Qiymətlər

Amiloid alfa-sinuklein (αS) aqreqasiyası Parkinson xəstəliyinin və digər sinükleinopatiyaların əlamətidir.Bu yaxınlarda, tez-tez Alzheimer xəstəliyi ilə əlaqəli tau zülalı αS patologiyası ilə əlaqələndirilmiş və iki zülalın koaqreqasiyasının molekulyar mexanizmi qeyri-müəyyən olaraq qalmasına baxmayaraq, αS ilə zəngin daxilolmalarda birgə lokalizasiyası aşkar edilmişdir.Burada αS fazasının tau kimi müsbət yüklü polipeptidlərlə elektrostatik kompleks kondensasiya yolu ilə maye kondensatlara ayrıldığını bildiririk.αS-nin polikatyonlara olan yaxınlığından və laxtalanma şəbəkəsinin valentlik azalma sürətindən asılı olaraq, laxtalar sürətli gelləşmə və ya birləşmədən sonra yavaş amiloid birləşməsindən keçir.Qabaqcıl biofiziki üsulların dəstini birləşdirərək, biz maye-maye αS/Tau faza ayrılmasını xarakterizə edə bildik və maye zülal kondensatında hər iki zülalı ehtiva edən heterojen aqreqatların əmələ gəlməsinə səbəb olan əsas amilləri müəyyən edə bildik.
Membran bölmələrinə əlavə olaraq, hüceyrələrdə məkan ayrılması, maye-maye faza ayrılması (LLPS) kimi tanınan bir proses vasitəsilə biomolekulyar kondensat və ya damcı adlanan zülalla zəngin, maye kimi sıx cisimlərin əmələ gəlməsi ilə də əldə edilə bilər.Bu damcılar adətən zülallar və ya zülallar və RNT arasında çoxvalentli müvəqqəti qarşılıqlı təsirlərdən əmələ gəlir və demək olar ki, bütün canlı sistemlərdə müxtəlif funksiyaları yerinə yetirir.Çoxlu sayda LLP qabiliyyətinə malik zülallar təbiətdə və biomolekulyar kondensatların əmələ gəlməsində çox nizamsız olan aşağı mürəkkəblik ardıcıllığını nümayiş etdirir3,4,5.Çoxsaylı eksperimental tədqiqatlar bu maye kimi kondensatları təşkil edən zülalların çevik, tez-tez nizamsız və çoxvalentli təbiətini ortaya qoydu, baxmayaraq ki, bu kondensatların böyüməsini və daha bərkəbənzər kondensatlara yetişməsini idarə edən xüsusi molekulyar determinantlar haqqında çox az şey məlumdur. dövlət..
Yeni məlumatlar aberrant zülalla idarə olunan LLPS və damcıların bərk strukturlara çevrilməsinin tez-tez degenerativ xəstəliklərin əlaməti olan həll olunmayan zəhərli aqreqatların meydana gəlməsinə səbəb olan müvafiq hüceyrə yolları ola biləcəyi fərziyyəsini dəstəkləyir.Çox vaxt yüksək yüklü və çevik olan LLPS ilə əlaqəli daxili nizamsız zülallar (İDP) uzun müddətdir ki, amiloid aqreqasiyası prosesi vasitəsilə neyrodegenerasiya ilə əlaqələndirilir.Xüsusilə, FUS7 və ya TDP-438 kimi biomolekulyar IDP kondensatlarının və ya hnRNPA19 kimi böyük mürəkkəblik domenləri olan zülalların mayeləşmə adlanan proses vasitəsilə gel kimi və ya hətta bərk formalara çevrildiyi göstərilmişdir.birləşmə.bərk faza keçidinə (LSPT) zaman funksiyası kimi və ya müəyyən posttranslational modifikasiyalara və ya patoloji əhəmiyyətli mutasiyalara cavab olaraq1,7.
In vivo LLPS ilə əlaqəli başqa bir məcburi köçkün, amiloid aqreqasiyası Alzheimer xəstəliyində10 iştirak edən, lakin bu yaxınlarda Parkinson xəstəliyində (PD) və digər sinaptik nüvə proteinopatiyaları 11, 12, 13 ilə əlaqəli olan mikrotubulla əlaqəli pozulmuş zülal olan Taudur.Taunun əlverişli elektrostatik qarşılıqlı təsirlərə görə məhluldan/sitoplazmadan kortəbii olaraq ayrılması14, nəticədə elektrostatik koaservatlar kimi tanınan tau ilə zənginləşdirilmiş damcıların əmələ gəlməsi göstərilmişdir.Bu tip qeyri-spesifik qarşılıqlı təsirin təbiətdəki bir çox biomolekulyar kondensatların hərəkətverici qüvvəsi olduğu da müşahidə edilmişdir15.Tau zülalının vəziyyətində, elektrostatik aqreqasiya zülalın əks yüklü bölgələrinin parçalanma prosesini tetiklediyi sadə aqreqasiya və ya RNT kimi mənfi yüklü polimerlərlə qarşılıqlı təsir yolu ilə kompleks birləşmə yolu ilə əmələ gələ bilər.
Bu yaxınlarda, α-sinuklein (αS), PD və kollektiv olaraq sinukleinopatiya kimi tanınan digər neyrodegenerativ xəstəliklərlə əlaqəli amiloid IDP17,18, mayeyə bənzər davranışı olan protein kondensatlarında cəmlənmiş hüceyrə və heyvan modellərində19,20 nümayiş etdirilmişdir.In vitro tədqiqatlar göstərmişdir ki, αS əsasən hidrofobik qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə sadə birləşmə yolu ilə LLPS-ə məruz qalır, baxmayaraq ki, bu proses olduqca yüksək protein konsentrasiyaları və atipik olaraq uzun inkubasiya vaxtları tələb edir19,21.İn vivo müşahidə edilən αS tərkibli kondensatların bu və ya digər LLPS prosesləri ilə əmələ gəlib-gəlməməsi həll edilməmiş əsas məsələ olaraq qalır.Eynilə, αS amiloid aqreqasiyası PD və digər sinükleinopatiyalarda neyronlarda müşahidə olunsa da, αS-nin hüceyrədaxili amiloid aqreqasiyasına məruz qalmasının dəqiq mexanizmi qeyri-müəyyən olaraq qalır, çünki bu zülalın həddindən artıq ifadəsi bu prosesi öz-özünə tətikləmir.Tez-tez əlavə hüceyrə zədələnməsi tələb olunur, bu da hüceyrədaxili αS amiloid birləşmələrinin renukleasiyası üçün müəyyən hüceyrə yerlərinin və ya mikro mühitlərin tələb olunduğunu göstərir.Xüsusilə birləşməyə meylli olan bir hüceyrə mühiti protein kondensatlarının 23 daxili hissəsi ola bilər.
Maraqlıdır ki, αS və tau-nun Parkinson xəstəliyi və digər sinükleinopatiyaları olan insanlarda xarakterik xəstəlik daxilolmalarında birgə lokalizasiyası aşkar edilmişdir 24,25 və təcrübələr iki zülal arasında sinergik patoloji əlaqənin olduğunu bildirmişdir 26,27 aqreqasiya αS və tau arasında potensial əlaqə olduğunu bildirmişdir. neyrodegenerativ xəstəliklərdə tau.xəstəlik.αS və tau-nun qarşılıqlı əlaqədə olduğu və bir-birinin aqreqasiyasını in vitro və in vivo təşviq etdiyi aşkar edilmişdir 28,29 və sinükleinopatiyaları olan xəstələrin beyinlərində bu iki zülaldan ibarət heterojen aqreqatlar müşahidə edilmişdir 30 .Bununla belə, αS və tau arasındakı qarşılıqlı təsirin molekulyar əsasları və onun birgə birləşmə mexanizmi haqqında çox az şey məlumdur.αS-nin αS-nin yüksək mənfi yüklü C-terminal bölgəsi və müsbət yüklü qalıqlarla zənginləşdirilmiş mərkəzi prolinlə zəngin tau bölgəsi arasında elektrostatik cazibə vasitəsilə tau ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğu bildirilir.
Bu tədqiqatda biz göstəririk ki, poli-L-lizin (pLK) kimi digər müsbət yüklü polipeptidlərlə qarşılıqlı təsirindən fərqli olaraq, tau zülalının iştirakı ilə αS elektrostatik kompleks kondensasiya yolu ilə həqiqətən damcılara ayrıla bilər və bu prosesdə .αS damcı şəbəkəsi üçün iskele molekulu kimi çıxış edir.Biz elektrostatik αS koaservatlarının yetişmə prosesində nəzərəçarpacaq fərqləri müəyyən etdik ki, bu da koaservat şəbəkəsində iştirak edən zülalların qarşılıqlı təsirinin valentliyi və gücü fərqləri ilə bağlıdır.Maraqlıdır ki, biz uzunömürlü maye koaservatlarda αS və tau amiloid zülallarının birgə birləşməsini müşahidə etdik və bu iki zülalın belə koaservatlarda birgə birləşməsinə səbəb olan bəzi əsas amilləri müəyyən etdik.Burada xəstəliyə xüsusi inklüzyonlarda iki zülalın kolokalizasiyasının əsasını təşkil edən mümkün molekulyar mexanizm olan bu prosesi ətraflı təsvir edirik.
αS neytral pH-da yüksək anion C-terminal quyruğuna malikdir (Şəkil 1a) və biz onun elektrostatik komplekslərin polikatyonik pozulmuş polipeptid molekulları ilə kondensasiyası vasitəsilə LLPS keçirə biləcəyini fərz etdik.Neytral pH 32-də müsbət yüklü və nizamsız polimer təbiətinə görə başlanğıc model molekulu kimi 100 qalıq poli-L-lizindən (pLK) istifadə etdik. Birincisi, pLK-nın Həll NMR spektroskopiyası vasitəsilə αS-in Ct sahəsi ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu təsdiq etdik. (Şəkil 1b) artan αS:pLK molar nisbətlərinin mövcudluğunda 13C/15N etiketli αS istifadə edərək.pLK-nin αS-nin Ct-domen ilə qarşılıqlı təsiri kimyəvi yerdəyişmənin pozulmalarında və zülalın bu bölgəsində pik intensivliyin azalmasında özünü göstərir.Maraqlıdır ki, αS-ni pLK ilə təxminən αS konsentrasiyasında qarışdırdığımızda.Polietilen qlikolun (5-15% PEG-8) iştirakı ilə 5-25 µM (tipik LLPS tamponu: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) biz dərhal protein əmələ gəlməsinin geniş sahəsindən keçdik. .damlacıqlar flüoresan (WF) və parlaq sahə (BF) mikroskopiyasından istifadə etməklə müşahidə edilmişdir (Şəkil 1c).Tərkibində konsentratlaşdırılmış αS (əlavə edilmiş 1 µM AlexaFluor488 etiketli αS, AF488-αS) olan 1-5 µm damcıların elektrostatik xassələri onların 10% 1,6-heksandiola (1,6-HD) müqavimətindən və onun həssaslığından əldə edilə bilər. NaCl konsentrasiyasının artması (Şəkil 1c).αS/pLK elektrostatik kompleksinin koaservatlarının mayeyə bənzər təbiəti onların millisaniyələr ərzində birləşmə qabiliyyəti ilə nümayiş etdirilir (şək. 1d).Turbidimetriyadan istifadə edərək, bu şərtlərdə damlacıqların əmələ gəlməsinin kəmiyyətini təyin etdik, onun sabitliyi ilə əlaqəli əsas qarşılıqlı təsirin elektrostatik təbiətini təsdiqlədik (şəkil 1e) və müxtəlif polimer nisbətlərinin LLPS prosesinə təsirini qiymətləndirdik (şəkil 1f).Damcı əmələ gəlməsi polimer nisbətlərinin geniş diapazonunda müşahidə olunsa da, pLK αS-dən artıq olduqda proses çox əlverişlidir.LLP-lər həmçinin kimyəvi cəhətdən fərqli yerdəyişmə agenti dekstran-70 (70 kDa) və ya şüşə slayd damcıları, müxtəlif materiallardan mikroplastinka quyuları, Eppendorf və ya kvars kapilyarları daxil olmaqla müxtəlif nümunə formatlarından istifadə etməklə də müşahidə edilmişdir.
Bu işdə istifadə edilən WT-αS və ΔCt-αS variantlarında müxtəlif zülal bölgələrinin sxematik təsviri.Amfipatik N-terminal sahəsi, hidrofobik amiloid əmələ gətirən (NAC) bölgəsi və mənfi yüklü C-terminal sahəsi müvafiq olaraq mavi, narıncı və qırmızı rənglərlə göstərilmişdir.WT-αS-nin Qalıq Başına Net Yükləmə (NCPR) xəritəsi göstərilir.b Makromolekulyar yığınlar olmadıqda αS/pLK qarşılıqlı təsirinin NMR analizi.pLK konsentrasiyası artdıqca (αS:pLK molar nisbətləri 1:0,5, 1:1,5 və 1:10 müvafiq olaraq açıq yaşıl, yaşıl və tünd yaşıl rənglərlə göstərilir).c LLPS buferində (yuxarıda) və ya 500 mM NaCl və ya sonra (solda) əlavə edilmiş αS/pLK (molyar nisbət 1:10) 25 µM (WF təsviri üçün 1 µM AF488 etiketli αS və ya Atto647N etiketli pLK)-da koaservasiya edin % 1,6-heksandiol (1,6-HD; aşağı sağ).Ölçək çubuğu = 20 µm.d 25 μM konsentrasiyada αS/pLK-nin (molyar nisbət 1:10) BF damcı füzyonunun reprezentativ mikroskopik şəkilləri;oxlar 200 ms ərzində fərdi damcıların (qırmızı və sarı oxlar) yeni damcıya (narıncı ox) birləşməsini göstərir).Ölçək çubuğu = 20 µm.e İşığın səpilməsi (350 nm-də) 25 µM αS-də 500 mM NaCl və ya 10% 1,6-HD əlavə edilməzdən əvvəl və sonra LLPS buferində αS/pLK aqreqasiyası (N = 3 nümunə təkrarı, orta və standart sapma da göstərilib).f αS:pLK molar nisbətinin artması ilə 25 μM αS-də αS/pLK aqreqasiyasının BF təsviri (yuxarıda) və işığın səpilmə analizi (350 nm, aşağıda) (N = 3 nümunə təkrarı, orta və standart sapma da göstərilmişdir).Ölçək çubuğu = 10 µm.Bir təsvirdəki miqyas çubuğu bir paneldəki bütün şəkillərin miqyasını göstərir.Xam verilənlər xam məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
αS/pLK elektrostatik kompleks kondensasiyası ilə bağlı müşahidələrimizə və tau31 ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqə yolu ilə tau/RNT kondensatının müştəri molekulu kimi αS-nin əvvəlki müşahidələrinə əsaslanaraq, RNT olmadıqda αS və tau-nun həlledici ilə birgə ayrıla biləcəyini fərz etdik. kondensasiya.elektrostatik komplekslər vasitəsilə və αS αS/Tau koaservatlarında iskele proteinidir (Şəkil 2e-də tau yükünün paylanmasına baxın).LLPS buferində 10 μM αS və 10 μM Tau441 (müvafiq olaraq 1 μM AF488-αS və 1 μM Atto647N-Tau ehtiva edən) qarışdırıldıqda, WF mikroskopiyası ilə göründüyü kimi, hər iki zülalı ehtiva edən zülal aqreqatlarını asanlıqla əmələ gətirdiklərini müşahidə etdik.(Şəkil 2a).Damcılardakı iki zülalın kolokalizasiyası konfokal (CF) mikroskopiyası ilə təsdiqləndi (Əlavə Şəkil 1a).Oxşar davranış dekstran-70-dən bir aqreqasiya agenti kimi istifadə edildikdə müşahidə edilmişdir (Əlavə Şəkil 1c).FITC etiketli PEG və ya dekstrandan istifadə edərək, hər iki sıxışdırıcı agentin nümunələr arasında bərabər paylandığını, nə seqreqasiya, nə də birləşmə göstərdiyini gördük (Əlavə Şəkil 1d).Əksinə, bu, bu sistemdə onların makromolekulyar sıxılma effektləri vasitəsilə faza ayrılmasını təşviq etdiyini göstərir, çünki PEG digər LLP sistemlərində33,34 göründüyü kimi üstünlüklü olaraq sabit sıxışdırıcı agentdir.Bu zülalla zəngin damcılar NaCl-ə (1 M) həssas idi, lakin 1,6-HD-yə (10% v/v) deyil, onların elektrostatik xüsusiyyətlərini təsdiqləyirdi (Əlavə Şəkil 2a, b).Onların maye davranışı BF mikroskopiyasından istifadə edərək millisaniyəlik birləşən damcı hadisələrini müşahidə etməklə təsdiq edilmişdir (Şəkil 2b).
LLPS tamponunda αS/Tau441 koaservatlarının konfokal (CF) mikroskop təsvirləri (hər zülaldan 10 μM, AF488 etiketli αS və Atto647N etiketli Tau441-dən 0.5 μM).b αS/Tau441 damcı birləşmə hadisələrinin diferensial müdaxilə kontrastının (DIC) təsvirləri (hər zülal üçün 10 μM).c 50 µM αS olmadıqda (solda) və ya mövcudluğunda (sağda) Tau441 LLPS (0-15 µM) işığın səpilməsinə (350 nm-də) əsaslanan faza diaqramı.Daha isti rənglər daha çox səpilməni göstərir.d Artan αS konsentrasiyası ilə αS/Tau441 LLPS nümunələrinin işığın səpilməsi (5 µM-də Tau441, N = göstərildiyi kimi 2-3 nümunə təkrarı).e Bu tədqiqatda istifadə olunan bəzi tau protein variantlarının və zülalın müxtəlif bölgələrinin sxematik təsviri: mənfi yüklü N-terminal domen (qırmızı), prolinlə zəngin bölgə (mavi), mikrotubul bağlayan sahə (MTBD, narıncı rənglə vurğulanmış) və amiloid əmələ gətirən cüt spiral.MTBD (boz) daxilində yerləşən filament bölgələri (PHF).Tau441-in Net Charge Per Residue (NCPR) xəritəsi göstərilir.f ΔNt-Tau (yuxarı, hər zülal üçün 10 µM) və ya K18 (alt, hər zülal üçün 10 µM) varlığında 1 µM AF488 etiketli αS və ya ΔCt-αS istifadə edərək, 1 µM AF488 etiketli αS və Atto647N etiketli ΔNt- istifadə etməklə ) ) ) LLPS və ya K18 buferində qatılaşdırılmış WF-nin mikroqrafikləri.Bir təsvirdəki miqyas çubuqları bir paneldəki bütün şəkillərin miqyasını təmsil edir (a, b və f panelləri üçün 20 µm).c və d panelləri üçün xam verilənlər xam məlumat faylları kimi təqdim olunur.
Bu LLPS prosesində αS-nin rolunu yoxlamaq üçün biz ilk növbədə artan NaCl konsentrasiyalarından istifadə edərək nefelometriya ilə αS-nin damcı sabitliyinə təsirini araşdırdıq (Şəkil 2c).αS ehtiva edən nümunələrdə duz konsentrasiyası nə qədər yüksəkdirsə, işığın səpilmə dəyərləri (350 nm-də) bir o qədər yüksəkdir, bu da bu LLPS sistemində αS-nin stabilləşdirici rolunu göstərir.Oxşar təsir αS konsentrasiyasını (və deməli, αS:Tau441 nisbətini) təqribən artırmaqla müşahidə edilə bilər.tau konsentrasiyasına (5 µM) nisbətən 10 qat artım (Şəkil 2d).αS-nin koaservatlarda iskele zülalı olduğunu nümayiş etdirmək üçün biz ΔNt-Tau adlanan mənfi yüklü N-terminal bölgəsi (qalıqlar 1-150, Şəkil 2e) olmayan LLPS ilə pozulmuş Tau mutantının davranışını araşdırmaq qərarına gəldik.WF mikroskopiyası və nefelometriyası ΔNt-Tau-nun özünün LLPS-dən keçmədiyini təsdiqlədi (Şəkil 2f və Əlavə Şəkil 2d), əvvəllər bildirildiyi kimi 14. Bununla belə, bu kəsilmiş Tau variantının dispersiya məhlullarına αS əlavə edildikdə, LLPS prosesi tamamilə baş verdi. oxşar şəraitdə və zülal konsentrasiyalarında Tau və αS-nin tam ölçülü məhlullarının damcı sıxlığına yaxın damcı sıxlığı ilə bərpa edilmişdir.Bu proses aşağı makromolekulyar sıxlıq şəraitində də müşahidə edilə bilər (Əlavə Şəkil 2c).LLPS prosesində C-terminal αS bölgəsinin rolu, lakin onun bütün uzunluğu deyil, (ΔCt-) qalıqları 104-140 (Şəkil 1a) olmayan C-terminalının kəsilmiş αS variantından istifadə edərək damlacıqların əmələ gəlməsinin qarşısını almaqla nümayiş etdirildi. αS) protein (Şəkil 2f və Əlavə Şəkil 2d).αS və ΔNt-Tau-nun kolokalizasiyası konfokal flüoresan mikroskopiyası ilə təsdiqləndi (Əlavə Şəkil 1b).
Tau441 və αS arasında LLPS mexanizmini daha da sınaqdan keçirmək üçün əlavə Tau variantından, yəni mikrotubula bağlayan domendə (MTBD) qoşalaşmış spiral filament nüvəsi (PHF) fraqmentindən istifadə edilmişdir, bu fraqment dörd xarakterik təkrar domendən ibarətdirsə, adətən də məlumdur. K18 fraqmenti kimi (bax. Şəkil 2e).Bu yaxınlarda bildirilmişdir ki, αS üstünlüklü olaraq prolinlə zəngin domendə yerləşən tau proteininə mikrotubul bağlayan domendən əvvəl gələn ardıcıllıqla bağlanır.Bununla belə, PHF bölgəsi həm də müsbət yüklü qalıqlarla zəngindir (bax Şəkil 2e), xüsusilə lizin (15% qalıq), bu da bizi bu bölgənin αS/Tau kompleksinin kondensasiyasına töhfə verib-vermədiyini yoxlamağa sövq etdi.Biz müşahidə etdik ki, K18 tək başına sınaqdan keçirilmiş şərtlərdə (15% PEG və ya 20% dekstran ilə LLPS tamponu) 100 μM-ə qədər konsentrasiyalarda LLPS-i tetikleyemez (Şəkil 2f).Bununla belə, biz 50 µM αS-ni 50 µM K18-ə əlavə etdikdə, nefelometriya (Əlavə Şəkil 2d) və WF mikroskopiyası (Şəkil 2f) ilə K18 və αS ehtiva edən protein damcılarının sürətli əmələ gəlməsi müşahidə edildi.Gözlənildiyi kimi, ΔCt-αS K18-in LLPS davranışını bərpa edə bilmədi (Şəkil 2f).Qeyd edək ki, αS/K18 aqreqasiyası αS/ΔNt-Tau və ya αS/Tau441 ilə müqayisədə LLPS-i induksiya etmək üçün bir qədər yüksək zülal konsentrasiyası tələb edir, digər şeylər bərabərdir.Bu, daha əvvəl təsvir edildiyi kimi, αS C-terminal bölgəsinin prolinlə zəngin Tau domeni ilə mikrotubul bağlayan domenlə müqayisədə daha güclü qarşılıqlı təsiri ilə uyğun gəlir.
ΔNt-Tau-nun αS olmadıqda LLPS-i yerinə yetirə bilməyəcəyini nəzərə alaraq, tam uzunluqlu Tau (izotip, Tau441/Tau441) ilə LLPS sistemlərində onun sadəliyini nəzərə alaraq, αS/Tau LLPS-ni xarakterizə etmək üçün model kimi bu Tau variantını seçdik.mürəkkəb (heterotipik, αS/Tau441) aqreqasiya prosesləri ilə.αS/Tau və αS/ΔNt-Tau sistemlərində αS aqreqasiya dərəcəsini (kondensasiya olunmuş faza zülalının bir hissəsi kimi, fαS,c) mərkəzdənqaçma və dispers faza SDS-PAGE analizi ilə müqayisə etdik (bax 2e), çox oxşar dəyərlər tapdı. eyni konsentrasiyada bütün zülallar üçün.Xüsusilə, αS/Tau və αS/ΔNt-Tau üçün müvafiq olaraq fαS,c 84 ± 2% və 79 ± 7% əldə etdik, bu da αS və tau arasındakı heterotipik qarşılıqlı təsirin tau molekulları arasındakı qarşılıqlı təsirdən üstün olduğunu göstərir.arasında.
Müxtəlif polikatyonlarla qarşılıqlı əlaqə və kondensasiya prosesinin αS kinetikasına təsiri ilk dəfə fotoağartma (FRAP) üsulundan sonra flüoresans bərpası ilə öyrənilmişdir.αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau və αS/pLK koaservatlarını sınaqdan keçirdik (2 μM αS AF488-αS və 100 μM Tau441 və ya ΔNt-Tau və ya 1 mM pLK ilə əlavə edilən 100 μM αS).Məlumat nümunə komponentləri qarışdırıldıqdan sonra ilk 30 dəqiqə ərzində əldə edilmişdir.Nümunəvi FRAP şəkillərindən (Şəkil 3a, αS/Tau441 kondensasiyası) və onların müvafiq zaman kursu əyrilərindən (Şəkil 3b, Əlavə Şəkil 3) αS kinetikasının Tau441 koaservatlarınınkinə çox oxşar olduğunu görmək olar.və pLK ilə daha sürətli olan ΔNt-Tau.FRAP-a uyğun olaraq koaservat daxilində αS üçün hesablanmış diffuziya əmsalları (Kang və başqaları tərəfindən təsvir edildiyi kimi) αS/Tau441 və α-S/ΔΔΔ üçün D = 0.013 ± 0.009 µm2/s və D = 0.026 ± 0.008 µm2/s-dir. αS/ sistemi.pLK, Tau və D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, müvafiq olaraq (Şəkil 3c).Bununla belə, dispers fazada diffuziya əmsalı αS eyni şəraitdə (LLPS buferi), lakin polikatsiyalar olmadıqda Floresen Korrelyasiya Spektroskopiyası (FCS, Əlavə Şəkil 3) ilə müəyyən edildiyi kimi bütün qatılaşdırılmış fazalardan bir neçə dəfə yüksəkdir. (D = 8 ± 4 µm2/s).Buna görə də, αS-in tərcüməsinin kinetikası aydın molekulyar sıxışdırma təsirləri səbəbindən dispers fazadakı zülallarla müqayisədə koaservatlarda əhəmiyyətli dərəcədə azalır, baxmayaraq ki, bütün koaservatlar tau fazasından fərqli olaraq, əmələ gəldikdən sonra ilk yarım saat ərzində mayeyə bənzər xüsusiyyətlərini saxlayırlar.pLK kondensatında daha sürətli kinetik.
a–c elektrostatik koaservatlarda αS dinamikasının (2% AF488 etiketli αS) FRAP təhlili.αS/Tau441 FRAP analizlərinin üç nüsxədə təsviri təsvirləri (a)-da göstərilmişdir, burada qırmızı dairələr rəngsizləşdirilmiş əraziləri göstərir.Ölçək çubuğu 5 µm-dir.b Orta FRAP əyriləri və (c) 100 µM αS və Tau441 (qırmızı) və ya ΔNt-Tau (mavi) və ya pLK (yaşıl) ekvimolyar konsentrasiyalarından istifadə edən üç təcrübədən 5-6 (N) müxtəlif damcı üçün hesablanmış diffuziya əmsalları (D) LLPS konsentrasiyasının on qatında.FRAP əyrisinin standart sapması kölgəli rənglə göstərilir.Müqayisə üçün, dispers fazada diffuziya əmsalı αS flüoresan korrelyasiya spektroskopiyasından (FCS) istifadə etməklə üç nüsxədə müəyyən edilmişdir (əlavə məlumat üçün Əlavə Şəkil 3 və üsullara baxın).d Heç bir polikatasiya olmadan (qara) və ya 100 μM Tau441 (qırmızı) və ya ΔNt-Tau (mavi) və ya 1 mM pLK (yaşıl) varlığında LLPS buferində 100 μM TEMPOL-122-αS davamlı X-zolağı EPR spektrləri.İçəridə ən dramatik dəyişikliklərin baş verdiyi güclü sahə xətlərinin böyüdülmüş görüntüsü göstərilir.e LLPS olmadıqda müxtəlif polikatyonlarla 50 μM TEMPOL-122-αS bağlama əyriləri (PEG yoxdur).Normallaşdırılmış EPR spektrinin II (III/III) zolağı ilə müqayisədə III bandının azaldılmış amplitudasının Tau441 (qırmızı), ΔNt-Tau (mavi) və pLK (yaşıl) molar nisbətlərini artırdığı göstərilir.Rəngli xətlər hər əyridə n ədəd eyni və müstəqil bağlama yeri olan kobud bağlama modelindən istifadə edərək məlumatlara uyğunluğu göstərir.Xam məlumatlar xam məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Əlavə olaraq, istiqamətləndirilmiş spin etiketləmə (SDSL) və davamlı elektron paramaqnit rezonansından (CW-EPR) istifadə edərək müxtəlif koaservatlarda αS dinamikasını araşdırdıq.Bu üsul məcburi köçkünlərin çevikliyi və dinamikası haqqında real qalıq qətnamə ilə hesabat vermək üçün çox faydalı olduğunu sübut etdi36,37,38.Bu məqsədlə, biz tək Cys mutantlarında sistein qalıqlarını qurduq və 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) spin probundan istifadə etdik.Maleimid törəmələri onları etiketləyir.Daha dəqiq desək, biz TEMPOL zondlarını 122 və ya 24 αS (TEMPOL-122-αS və TEMPOL-24-αS) mövqeyinə daxil etdik.Birinci halda, biz polikatyonlarla qarşılıqlı əlaqədə olan zülalın C-terminal bölgəsini hədəfləyirik.Bunun əvəzinə 24-cü mövqe bizə kondensatdakı zülalların ümumi dinamikası haqqında məlumat verə bilər.Hər iki halda dispers fazanın zülalları üçün əldə edilən EPR siqnalları sürətlə hərəkət edən vəziyyətdə olan nitroksid radikallarına uyğun gəlirdi.Tau və ya pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 və ya ΔNt-Tau 1:1 nisbətində və ya 1:10 nisbətində pLK) iştirakı ilə faza ayrıldıqdan sonra nisbi pik intensivliyində artım müşahidə edildi. αS-in EPR spektri.İtki xətti genişləndi, bu, seyreltilmiş fazadakı zülalla müqayisədə damcılarda αS yönləndirmə kinetikasının azaldığını göstərir (Şəkil 3d, Əlavə Şəkil 4a).Bu dəyişikliklər 122-ci mövqedə daha qabarıq şəkildə özünü göstərir. 24-cü mövqedə pLK-nın olması zondun kinetikasına təsir etməsə də, 122-ci mövqedə spektral xəttin forması əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdi (Əlavə Şəkil 4a).Spin etiketli IDP38,39-un dinamikasını təsvir etmək üçün adətən istifadə olunan izotrop modeldən (Əlavə Şəkil 5a) istifadə edərək iki αS/polikasiya sisteminin 122-ci mövqeyində spektrləri modelləşdirməyə cəhd etdiyimiz zaman eksperimental spektrləri yenidən qura bilmədik..24 fırlanma kontrastının mövqeyinin spektral simulyasiyası (Əlavə Şəkil 5a).Bu, polikatyonların mövcudluğunda αS-nin C-terminal bölgəsinin spin konfiqurasiyaları məkanında üstünlüklü mövqelərin olduğunu göstərir.Eksperimental EPR şərtləri altında qatılaşdırılmış fazada αS-nin payını nəzərdən keçirərkən (αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau və αS/pLK üçün müvafiq olaraq 84 ± 2%, 79 ± 7% və 47 ± 4% - Əlavəyə baxın. Şəkil 2e məlumatların təhlili c), görünə bilər ki, EPR üsulu ilə aşkar edilən genişlənmə, əsasən, αS-nin C-terminal bölgəsinin kondensasiya mərhələsində müxtəlif polikatsiyalarla qarşılıqlı təsirini əks etdirir (TEMPOL-122-dən istifadə edərkən əsas dəyişiklik). αS) və zülal kondensasiyası deyil.Probda mikroviskozitenin artması müşahidə edilir.Gözlənildiyi kimi, qarışığa 1 M NaCl əlavə edildikdə, LLPS-dən başqa şərtlər altında zülalın EPR spektri tamamilə bərpa edildi (Əlavə Şəkil 4b).Ümumilikdə, məlumatlarımız göstərir ki, CW-EPR tərəfindən aşkar edilən dəyişikliklər əsasən αS-nin C-terminal bölgəsinin kondensasiya mərhələsində müxtəlif polikatsiyalarla qarşılıqlı təsirini əks etdirir və bu qarşılıqlı təsir pLK ilə Tau ilə müqayisədə daha güclü görünür.
Koaservatdakı zülallar haqqında daha struktur məlumat əldə etmək üçün məhlulda NMR-dən istifadə edərək LLPS sistemini araşdırmaq qərarına gəldik.Bununla belə, biz yalnız dispers fazada qalan αS fraksiyasını aşkar edə bildik ki, bu da NMR analizində koaservat daxilində azalmış zülal dinamikasına və məhlulun dibində sıx fazaya görə ola bilər.NMR (Əlavə Şəkil 5c, d) istifadə edərək LLPS nümunəsinin dispers fazasında qalan zülalın strukturunu və dinamikasını təhlil etdikdə, zülalın pLK və ΔNt-Tau varlığında demək olar ki, eyni davrandığını gördük. zülal onurğasının ikinci dərəcəli quruluşu və dinamikasında olan, ikincil kimyəvi sürüşmə və R1ρ relaksasiyası ilə bağlı təcrübələrlə aşkar edilmişdir.NMR məlumatları göstərir ki, αS-nin C-terminusu, zülal ardıcıllığının qalan hissəsi kimi, polikatyonlarla qarşılıqlı əlaqəsi səbəbindən nizamsız təbiətini qoruyarkən, konformasiya elastikliyini əhəmiyyətli dərəcədə itirir.
TEMPOL-122-αS qatılaşdırılmış fazasında müşahidə olunan CW-EPR siqnalının genişlənməsi zülalın polikatyonlarla qarşılıqlı təsirini əks etdirdiyi üçün biz LLPS olmadığı halda αS-nin müxtəlif polikatsiyalara bağlanma yaxınlığını qiymətləndirmək üçün EPR titrləməsi həyata keçirdik. Bufer LLPS), qarşılıqlı təsirlərin seyreltilmiş və konsentratlaşdırılmış fazalarda eyni olduğunu təklif edir (bu, bizim məlumatlarımızla təsdiqlənir, Əlavə Şəkil 4a və Əlavə Şəkil 6).Məqsəd, ümumi maye kimi xüsusiyyətlərinə baxmayaraq, bütün koaservatların molekulyar səviyyədə hər hansı əsas diferensial davranış nümayiş etdirib-göstərmədiyini görmək idi.Gözlənildiyi kimi, EPR spektri artan polikasiya konsentrasiyası ilə genişləndi və bu, bütün qarşılıqlı təsir tərəfdaşlarının molekulyar qarşılıqlı təsirləri səbəbindən molekulyar çevikliyin demək olar ki, doyma səviyyəsinə qədər azaldığını əks etdirdi (Şəkil 3e, Əlavə Şəkil 6).pLK bu doymaya ΔNt-Tau və Tau441 ilə müqayisədə daha aşağı molar nisbətdə (polikasiya:αS) nail olmuşdur.Əslində, n eyni və müstəqil bağlanma yerini fərz edən məlumatların təxmini bağlanma modeli ilə müqayisəsi göstərdi ki, pLK-nin görünən dissosiasiya sabiti (~5 μM) Tau441 və ya ΔNt-Tau (~50 μM) ilə müqayisədə daha aşağı miqyasdadır. ).µM).Bu təxmini hesablama olsa da, bu, αS-nin davamlı müsbət yük bölgələri olan daha sadə polikatsiyalar üçün daha yüksək yaxınlığa malik olduğunu göstərir.αS və müxtəlif polikatsiyalar arasında yaxınlıqdakı bu fərqi nəzərə alaraq, onların maye xassələrinin zamanla fərqli dəyişə biləcəyini və beləliklə də müxtəlif LSPT proseslərindən əziyyət çəkə biləcəyini fərz etdik.
Zülal koaservatının içərisində yüksək sıxlıq mühiti və zülalın amiloid təbiətini nəzərə alaraq, mümkün LSPT proseslərini aşkar etmək üçün zamanla koaservatın davranışını müşahidə etdik.BF və CF mikroskopiyasından (Şəkil 4) istifadə edərək, αS/Tau441-in məhlulda böyük ölçüdə koaservasiya etdiyini, gözlənildiyi kimi quyunun/slaydın dibində səthlə təmasda olan və nəmləndirən böyük damcıların əmələ gəldiyini müşahidə etdik (Əlavə Şəkil 1). 7d);biz bu dibdən əmələ gələn strukturları “zülal salları” adlandırırıq.Bu strukturlar ərimə qabiliyyətini saxladıqları üçün maye olaraq qaldılar (Əlavə Şəkil 7b) və LLPS işə salındıqdan sonra bir neçə saat ərzində görünə bildilər (Şəkil 4 və Əlavə Şəkil 7c).Müşahidə etdik ki, balanslaşdırılmamış yükləri və beləliklə də yüksək elektrostatik səth potensialı olan elektrostatik koaservatlar üçün gözlənildiyi kimi, islatma prosesinin hidrofobik materiallardan daha çox hidrofilik materialların səthində üstünlük təşkil etməsi (Əlavə Şəkil 7a).Qeyd edək ki, αS/ΔNt-Tau birləşməsi və rafting əhəmiyyətli dərəcədə azalıb, αS/pLK kondensatları isə əhəmiyyətli dərəcədə azalıb (Şəkil 4).Qısa inkubasiya zamanı αS/pLK damcıları birləşərək hidrofilik səthi nəmləndirə bildilər, lakin bu proses tez dayandı və 5 saatlıq inkubasiyadan sonra yalnız məhdud birləşmə hadisələri və islanma müşahidə olunmadı.– gel-damcı keçidi.
LLPS buferində 100 µM Tau441 (yuxarı) mikroskopik təsvirlər)ΔNt mövcudluğunda 100 µM αS (1% flüoresan etiket) olan koaservat nümunələrinin nümayəndəsi BF (boz rəngli panellər) və CF (sağ panellər, yaşıl rəngdə AF488 etiketli αS) -Tau (mərkəz) və ya 1 mM pLK (aşağı) müxtəlif inkubasiya vaxtlarında və fokus yüksəkliklərində (z, boşqab quyusunun dibindən məsafə).Təcrübələr eyni nəticələrlə bir-birindən asılı olmayaraq 4-6 dəfə təkrarlandı.αS/Tau441 koaservatları 24 saatdan sonra ıslanır və təsvirdən daha böyük sallar əmələ gətirir.Bütün şəkillər üçün miqyas çubuğu 20 µm-dir.
Daha sonra αS/Tau441 LLPS-də əmələ gələn mayeyə bənzər böyük zülal hovuzlarının öyrənilən zülallardan hər hansı birinin amiloid birləşməsinə gətirib çıxaracağını soruşduq.WF mikroskopiyası ilə αS/Tau441 damcılarının zamanla olgunlaşmasını yuxarıda göstərilən şərtlər altında, lakin 1 μM AF488 etiketli αS və Atto647N etiketli Tau441 istifadə edərək izlədik (Şəkil 5a).Gözlənildiyi kimi, biz olgunlaşma prosesi boyunca tam protein lokalizasiyasını müşahidə etdik.Maraqlıdır ki, təxminən.5 saatdan sonra salların içərisində daha intensiv qeyri-dairəvi strukturlar müşahidə olundu ki, biz onları “nöqtələr” adlandırdıq, onların bir qismi αS ilə kolokallaşdırıldı, bəziləri isə Tau441-də zənginləşdi (şək. 5a, ağ oxlar).Bu ləkələr həmişə αS/ΔNt-Tau ilə müqayisədə daha çox αS/ΔNt-Tau üçün sallarda müşahidə edilmişdir.pLK və Tau sistemlərinin damcılarında füzyon/ıslatma üçün səriştəsiz heç bir aydın ləkə yox idi.Tərkibində αS və Tau441 olan bu ləkələrin amiloidə bənzər aqreqatlar olub-olmadığını yoxlamaq üçün biz CF mikroskopundan istifadə edərək oxşar təcrübə apardıq, burada Tau441 Atto647N ilə etiketləndi və əvvəldən 12,5 μM amiloidə xas tioflavin-T (ThT) əlavə edildi.boya.αS/Tau441 damcılarının və ya sallarının ThT-ləkələnməsi hətta 24 saatlıq inkubasiyadan sonra da müşahidə edilməsə də (Şəkil 5b, üst sıra-zülal salları üzərində qalan damcılar), salların içərisində Atto647N-Tau441 olan ThT-müsbət strukturlar çox zəif idi.bu, əvvəllər təsvir edilmiş ləkələrin ölçüsünü, formasını və yerini təkrarlayır (şək. 5b, orta və alt sıralar), ləkələrin qocalmış maye koaservatlarında əmələ gələn amiloid kimi aqreqatlara uyğun ola biləcəyini göstərir.
WF 25 μM αS müxtəlif inkubasiya vaxtlarında və fokus hündürlüklərində (z, bağlanmamış dibdən məsafə) 25 μM Tau441 (LLPS bufferli mikroskop lövhəsinin quyusunda 1 μM AF488 etiketli αS və Atto647N etiketli Tau441) varlığında) .Altı təcrübə müstəqil olaraq oxşar nəticələrlə təkrarlandı.b 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N etiketli Tau441) və 12.5 μM tioflavin-T (ThT) varlığında 25 μM αS-in CF mikroskopik şəkli.Çəkili zülal damcıları və yığılmış protein salları və ləkələri müvafiq olaraq yuxarı və orta cərgələrdə göstərilir.Aşağı cərgədə 3 müstəqil surətdən sal və damcıların təsvirləri göstərilir.Ağ oxlar hər iki paneldə ThT-müsbət nöqtələri göstərir.Bütün şəkillər üçün miqyas çubuğu 20 µm-dir.
Mayedən bərkə keçid zamanı koaservat zülal şəbəkəsindəki dəyişiklikləri daha ətraflı araşdırmaq üçün flüoresan ömür boyu görüntüləmə (FLIM) və Förster rezonans enerji ötürmə mikroskopiyasından (FRET) istifadə etdik (Şəkil 6 və Əlavə Şəkillər 8 və 9).Biz fərz etdik ki, təbəqənin daha qatılaşdırılmış və ya hətta bərkəbənzər məcmu zülal strukturuna koaservativ yetkinləşməsi zülal və ona qoşulmuş flüoresan zond arasında daha sıx əlaqəyə gətirib çıxarır və potensial olaraq qısaldılmış zond ömründə (τ) özünü göstərən söndürmə effekti yaradır. , əvvəllər təsvir edildiyi kimi40.,41 ,42.Bundan əlavə, ikiqat etiketli nümunələr üçün (müvafiq olaraq FRET donoru və akseptor boyaları kimi AF488 və Atto647N) τ-da bu azalma həmçinin koaservat kondensasiyası və LSPT zamanı FRET(E) səmərəliliyinin artması ilə müşayiət oluna bilər.Biz LLPS αS/Tau441 və αS/ΔNt-Tau nümunələrində (1 µM AF488 etiketli αS və/və ya Tau441 və ya ΔNt-Tau etiketli Atto647N ehtiva edən LLPS buferində hər zülalın 25 µM) zamanla sal və ləkə əmələ gəlməsinə nəzarət etdik.Biz ümumi bir tendensiya müşahidə etdik ki, AF488 (τ488) və Atto647N (τ647N) zondlarının flüoresans ömrünün koaservatlar yetişdikcə bir qədər azaldı (Şəkil 6 və Əlavə Şəkil 8c).Maraqlıdır ki, bu dəyişiklik salların içərisindəki nöqtələr üçün əhəmiyyətli dərəcədə gücləndirilmişdir (Şəkil 6c, bu da nöqtələrdə daha çox protein kondensasiyasının baş verdiyini göstərir.Bunu dəstəkləmək üçün, 24 saat yaşlı αS/ΔNt-Tau damcıları üçün flüoresans müddətində əhəmiyyətli dəyişiklik müşahidə edilmədi (Əlavə Şəkil 8d), damcı jelləşməsinin ləkələnmədən fərqli bir proses olduğunu və əhəmiyyətli molekulyar yenidən təşkili ilə müşayiət olunmadığını göstərir. koaservatlar daxilində.Qeyd etmək lazımdır ki, nöqtələr αS-də, xüsusən αS/Tau441 sistemi üçün müxtəlif ölçülərə və dəyişən məzmuna malikdir (Əlavə Şəkil 8e).Ləkə flüoresansının ömrünün azalması, xüsusilə Tau441 etiketli Atto647N (Əlavə Şəkil 8a) üçün intensivliyin artması və həm αS/Tau441, həm də αS/ΔNt-Tau sistemləri üçün daha yüksək FRET səmərəliliyi ilə müşayiət olundu ki, bu da LLPS-də daha beş saatlıq kondensasiya olduğunu göstərir. tetiklendikten sonra statik elektrikin içindəki zülallar qatılaşdı.αS/ΔNt-Tau ilə müqayisədə biz αS/Tau441 ləkələrində daha aşağı τ647N və bir qədər yüksək τ488 dəyərlərini daha aşağı və daha qeyri-homogen FRET dəyərləri ilə müşahidə etdik.Ola bilsin, bu, αS/Tau441 sistemində aqreqatlarda müşahidə edilən və gözlənilən αS bolluğunun Tau ilə müqayisədə daha heterojen, çox vaxt substoixiometrik olması ilə əlaqədar ola bilər, çünki Tau441 özü də LLPS və aqreqasiyaya məruz qala bilər (Əlavə Şəkil 8e) .Bununla belə, həm Tau441, həm də αS mövcud olduqda damlacıqların birləşmə dərəcəsi, sal əmələ gəlməsi və ən əsası, maye kimi koaservatlar daxilində zülal aqreqasiyası maksimal olur.
αS/Tau441 və αS/ΔNt-Tau-nun hər zülalın 25 μM-də (1 μM AF488 etiketli αS və 1 μM Atto647N etiketli Tau441 və ya ΔNt-PS-Tau) ömür boyu flüoresan mikroskopiyası (FLIM) şəkilləri.Sütunlar müxtəlif yetişmə vaxtlarında (30 dəq, 5 saat və 24 saat) LLPS nümunələrinin nümayəndə şəkillərini göstərir.Qırmızı çərçivə αS/Tau441 ləkələri olan bölgəni göstərir.Həyat müddətləri rəng çubuqları kimi göstərilir.Bütün şəkillər üçün miqyas çubuğu = 20 µm.b Panel adakı qırmızı qutuda göstərilən seçilmiş ərazinin böyüdülmüş FLIM şəkli.Həyat diapazonları a panelində olduğu kimi eyni rəng şkalası ilə göstərilir.Ölçək çubuğu = 5 µm.c Tau441 və αS- üçün qeydə alınmış FLIM təsvirlərində müəyyən edilmiş müxtəlif zülal növləri (damlalar-D-, sal-R- və ləkə-P) üçün AF488 (αS-ə əlavə olunur) və ya Atto647N-ni (Tau-ya əlavə olunur) göstərən histoqramlar və αS/ΔNt-Tau koaservat nümunələri (D üçün N = 17-32 ROI, R üçün 29-44 ROI və xallar üçün 21-51 ROI).Orta və median dəyərlər müvafiq olaraq qutuların içərisində sarı kvadratlar və qara xətlər şəklində göstərilir.Qutunun aşağı və yuxarı sərhədləri müvafiq olaraq birinci və üçüncü kvartilləri təmsil edir və 1,5 qat interquartile diapazonu (IQR) daxilində minimum və maksimum dəyərlər bığ kimi göstərilir.Xaricilər qara brilyant kimi göstərilir.Paylanma cütləri arasında statistik əhəmiyyət, qeyri-bərabər dispersiyaları qəbul edərək iki nümunəli t-testindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir.İki quyruqlu t-test p-dəyərləri müqayisə edilən məlumatların hər bir cütü üçün ulduz işarələri ilə göstərilir (* p-dəyəri > 0.01, ** p-dəyəri > 0.001, *** p-dəyəri > 0.0001, **** p-dəyəri > 0,00001), ns əhəmiyyətsizliyi göstərir (p-dəyəri > 0,05).Dəqiq p dəyərləri Əlavə Cədvəl 1-də verilmişdir və orijinal məlumatlar xam məlumat faylları kimi təqdim edilmişdir.
Ləkələrin/aqreqatların amiloidəbənzər təbiətini daha da nümayiş etdirmək üçün biz 24 saat ərzində yüksək (1 M) NaCl konsentrasiyası ilə ləkələnməmiş koaservat nümunələrini müalicə etdik ki, bu da aqreqatların zülal koaservatlarından ayrılması ilə nəticələndi.İzolyasiya edilmiş aqreqatlar (yəni, aqreqatların dispers məhlulu) atom qüvvəsi mikroskopiyasından (AFM) istifadə edilməklə müşahidə edildikdə, biz təxminən 15 nm müntəzəm hündürlüyə malik, əsasən sferik morfologiyanı müşahidə etdik və bu morfologiya yüksək duz konsentrasiyası şəraitində birləşməyə meyllidir. səthdə güclü hidrofobik təsirə görə tipik amiloid fibrillərinin davranışı (qeyd edək ki, fibrillər adətən ~10 nm hündürlüyə malikdir) (Əlavə Şəkil 10a).Maraqlıdır ki, təcrid olunmuş aqreqatlar standart ThT flüoresan analizində ThT ilə inkubasiya edildikdə, biz ThT flüoresans kvant məhsuldarlığında, boyanın tipik αS amiloid lifləri ilə inkubasiya edildiyi zaman müşahidə olunanla müqayisə oluna bilən dramatik artım müşahidə etdik (Əlavə Şəkil 10b) koaservat aqreqatlarında amiloid kimi strukturlar var..Əslində, aqreqatlar yüksək duz konsentrasiyalarına dözümlü idi, lakin tipik amiloid fibrilləri kimi 4 M guanidin xloridinə (GdnHCl) həssas idi (Əlavə Şəkil 10c).
Sonra, tək molekullu flüoresan, xüsusi flüoresan korrelyasiya/çarpaz korrelyasiya spektroskopiyası (FCS/FCCS) və iki rəngli təsadüf aşkarlamasının (TCCD) partlayış analizindən istifadə edərək aqreqatların tərkibini təhlil etdik.Bu məqsədlə, 1 μM AF488 etiketli αS və 1 μM Atto647N etiketli Tau441 ilə birlikdə αS və Tau441 (hər ikisi 25 μM) olan 100 μl LLPS nümunələrində 24 saat inkubasiyadan sonra əmələ gələn aqreqatları təcrid etdik.LLPS və zülal arasında mümkün elektrostatik qarşılıqlı təsirlərin qarşısını almaq üçün eyni PEG-sərbəst tampon və 1 M NaCl (koaservatdan aqreqatları ayırmaq üçün istifadə edilən eyni tampon) istifadə edərək, nəticədə yayılmış aqreqat məhlulunu monomolekulyar vəziyyətə gətirin.Tək molekulun zaman trayektoriyasına misal Şəkil 7a-da göstərilə bilər.FCCS/FCS təhlili (çarpaz korrelyasiya, CC və avtokorrelyasiya, AC) nümunələrdə αS və tau olan aqreqatların bol olduğunu göstərdi (Şəkil 7b, sol paneldə CC əyrisinə baxın) və qalıq monomerik zülalın artıqlığı seyreltmə prosesinin nəticəsi (Şəkil 7b, sol paneldə AC əyrilərinə baxın).Tərkibində yalnız monomerik zülallar olan nümunələrdən istifadə etməklə eyni məhlul şəraitində aparılan nəzarət təcrübələri heç bir CC əyrisini göstərmədi və AC əyriləri monomer zülalların gözlənilən diffuziya əmsallarına malik olduğu birkomponentli diffuziya modeli (Eq. 4) ilə yaxşı uyğunlaşır (Şəkil 7b). ), sağ panel).Birləşdirilmiş hissəciklərin diffuziya əmsalı 1 µm2/s-dən az, monomerik zülallarınki isə təxminən 1 µm2/s-dir.50-100 µm/s;dəyərlər, oxşar həll şərtləri altında ayrı-ayrılıqda sonikləşdirilmiş αS amiloid fibrilləri və monomerik αS üçün əvvəllər dərc edilmiş dəyərlərə bənzəyir44.Aqreqatları TCCD partlayış analizi ilə təhlil etdikdə (Şəkil 7c, yuxarı panel), biz aşkar etdik ki, hər bir təcrid olunmuş aqreqatda (αS/Tau heteroaqreqat) aşkar edilmiş aqreqatların təxminən 60%-i həm αS, həm də tau, təxminən 30%-i isə yalnız tau, yalnız təxminən 10% αS.αS/Tau heteroaqreqatlarının stokiometrik təhlili göstərdi ki, heteroaqreqatların əksəriyyəti tau ilə zənginləşdirilmişdir (stoixiometriya 0,5-dən aşağıdır, aqreqat başına tau molekullarının orta sayı αS molekullarından 4 dəfə çoxdur), bu, situ-da FLIM-də müşahidə etdiyimiz işimizə uyğundur. təcrübələr..FRET təhlili göstərdi ki, bu aqreqatlarda hər iki zülal var, baxmayaraq ki, bu halda faktiki FRET dəyərləri böyük əhəmiyyət kəsb etmir, çünki təcrübədə istifadə olunan etiketsiz zülalın çox olması səbəbindən hər bir aqreqatda flüoroforların paylanması təsadüfi olub.Maraqlıdır ki, 45,46 yetkin amiloid aqreqasiyası çatışmazlığı olan Tau variantından istifadə edərək eyni təhlili apardıqda (bax. Əlavə Şəkil 11a, b), αS elektrostatik birləşməsinin eyni olmasına baxmayaraq (Əlavə Şəkil 11c, d), koaservat daxilində aqreqatlar yaratmaq qabiliyyəti kəskin şəkildə azaldı və FLIM in situ təcrübələrində bir neçə ləkə aşkar etdi və təcrid olunmuş məcmu nümunələr üçün zəif çarpaz korrelyasiya əyriləri müşahidə edildi.Bununla belə, az sayda aşkar edilmiş aqreqatlar üçün (Tau441-in yalnız onda biri) biz müşahidə etdik ki, hər bir aqreqat bu Tau variantından fərqli olaraq αS ilə zənginləşib, aşkar edilmiş aqreqatların təxminən 50%-də yalnız αS molekulları var və αS həddindən artıq heterojen olub. .Tau441 tərəfindən yaradılan heterojen aqreqatlardan fərqli olaraq (Şəkil 6f) aqreqatlar (Əlavə Şəkil 11e-ə baxın).Bu təcrübələrin nəticələri göstərdi ki, αS özü koaservat daxilində tau ilə toplana bilsə də, bu şəraitdə tau nüvələşməsi daha əlverişlidir və yaranan amiloid kimi aqreqatlar αS və tau forması kimi çıxış edə bilir.Bununla belə, tau ilə zəngin nüvə meydana gəldikdən sonra, αS və tau arasında heterotipik qarşılıqlı təsirlər tau molekulları arasında homotipik qarşılıqlı təsirlərə nisbətən aqreqatlarda üstünlük təşkil edir;maye αS/tau koaservatlarında zülal şəbəkələrini də müşahidə edirik.
αS/Tau441 elektrostatik koaservatlarda əmələ gələn təcrid olunmuş aqreqatların tək molekullarının flüoresan temporal izləri.αS/Tau441 koaqreqatlarına uyğun gələn partlayışlar (göstərilən həddən yuxarı partlamalar) üç aşkarlama kanalında (AF488 və birbaşa həyəcandan sonra Atto647N emissiyası, mavi və qırmızı xətlər, dolayı həyəcandan sonra Atto647N emissiyası), FRET, bənövşəyi xətt) müşahidə edilmişdir.b LLPS-dən əldə edilmiş təcrid olunmuş αS/Tau441 aqreqatlarının nümunəsinin FCS/FCCS təhlili (sol panel).AF488 və Atto647N üçün avtokorrelyasiya (AC) əyriləri müvafiq olaraq mavi və qırmızı rənglərlə, hər iki boyanı ehtiva edən aqreqatlarla əlaqəli çarpaz korrelyasiya (CC) əyriləri bənövşəyi rəngdə göstərilmişdir.AC əyriləri etiketlənmiş monomerik və yığılmış zülal növlərinin mövcudluğunu əks etdirir, CC əyriləri isə yalnız ikiqat etiketli aqreqatların diffuziyasını göstərir.Eyni analiz, lakin təcrid olunmuş ləkələrdə olduğu kimi eyni həll şərtləri altında, yalnız monomerik αS və Tau441 ehtiva edən nümunələr sağ paneldə nəzarət elementləri kimi göstərilir.c αS/Tau441 elektrostatik koaservatlarda əmələ gələn təcrid olunmuş aqreqatların tək molekullarının flüoresan flaş analizi.Dörd fərqli təkrarda (N = 152) tapılan hər bir aqreqat üçün məlumat onların stexiometriyasına, S qiymətlərinə və FRET səmərəliliyinə qarşı tərtib edilir (üst panel, rəng zolağı baş verməni əks etdirir).Üç növ aqreqat ayırd edilə bilər: -αS-yalnız S~1 və FRET~0 olan aqreqatlar, S~0 və FRET~1 olan yalnız Tau aqreqatları və aralıq S və FRET olan heterojen Tau/αS aqreqatları. hər bir heterojen məcmuədə aşkar edilmiş hər iki marker zülalının (N = 100) aşağı paneldə göstərilir (rəng şkalası hadisəni əks etdirir).Xam məlumatlar xam məlumat faylları şəklində təqdim olunur.
Maye zülal kondensatlarının zamanla geləbənzər və ya bərk strukturlara yetişməsi və ya yaşlanmasının kondensatın47 bir sıra fizioloji funksiyalarında, eləcə də amiloid birləşməsindən əvvəlki anormal proses kimi xəstəliklərdə iştirak etdiyi bildirilir 7, 48, 49. Burada faza ayrılmasını və davranışını ətraflı öyrənirik.Aşağı mikromolyar konsentrasiyalarda və fizioloji cəhətdən uyğun şərtlərdə idarə olunan mühitdə təsadüfi polikatyonların mövcudluğunda LSPT αS (nəzərə alın ki, αS-nin hesablanmış fizioloji konsentrasiyası >1 µM50-dir), LPS-nin tipik termodinamik idarə olunan davranışından sonra.Fizioloji pH-da yüksək mənfi yüklü C-terminal bölgəsini ehtiva edən αS-nin elektrostatik proses vasitəsilə pLK və ya Tau kimi yüksək kationik nizamsız peptidlərin iştirakı ilə LLPS vasitəsilə sulu məhlulda zülalla zəngin damcılar əmələ gətirə bildiyini aşkar etdik. aqreqasiya makromolekullarının iştirakı ilə mürəkkəb kondensasiya.Bu proses αS-nin həm in vitro, həm də in vivo olaraq xəstəliklə əlaqəli aqreqasiyası ilə əlaqəli müxtəlif polikatyonik molekullarla qarşılaşdığı hüceyrə mühitində müvafiq təsirlərə malik ola bilər51,52,53,54.
Bir çox tədqiqatlarda damcıların daxilindəki zülal dinamikası yetişmə prosesini təyin edən əsas amillərdən biri kimi qəbul edilmişdir55,56.Polikatyonlarla elektrostatik αS koaservatlarında yetişmə prosesi, görünür, polikatyonlarla qarşılıqlı təsirlərin gücündən, valentlikdən və bu qarşılıqlı təsirlərin çoxluğundan asılıdır.Tarazlıq nəzəriyyəsi göstərir ki, iki maye vəziyyətin tarazlıq mənzərəsi LLPS-ni hərəkətə gətirən biopolimerlərlə zəngin böyük bir damlacıqın olmasıdır57,58.Damcıların böyüməsinə Ostwald yetişməsi59, birləşmə60 və ya dispers fazada sərbəst monomerin istehlakı61 ilə nail olmaq olar.αS və Tau441, ΔNt-Tau və ya pLK üçün zülalın çox hissəsi bu tədqiqatda istifadə olunan şəraitdə kondensatda cəmləşmişdir.Bununla belə, tam ölçülü tau damcıları səthin islanmasından sonra sürətlə birləşsə də, damcıların birləşməsi və islanması ΔNt-Tau və pLK üçün çətin idi və bu, bu iki sistemdə maye xüsusiyyətlərinin sürətlə itirilməsini göstərirdi.FLIM-FRET analizimizə əsasən, yaşlı pLK və ΔNt-Tau damcıları orijinal damcılarla oxşar zülal birləşmə dərəcəsini (oxşar flüoresan ömrü) göstərdi və bu, orijinal zülal şəbəkəsinin daha sərt olsa da, saxlanıldığını göstərir.
Eksperimental nəticələrimizi aşağıdakı modeldə rasionallaşdırırıq (Şəkil 8).Əvvəlcə müvəqqəti əmələ gələn damcılar çox vaxt elektrostatik kompensasiyası olmayan zülal şəbəkələridir və beləliklə, xüsusilə damcı interfeysində yük balanssızlığı sahələri var və nəticədə yüksək elektrostatik səth potensialına malik olan damcılar yaranır.Yükü kompensasiya etmək (ümumiyyətlə valentliyin tükənməsi adlanır) və damcıların səth potensialını minimuma endirmək üçün damcılar seyreltilmiş fazadan yeni polipeptidləri daxil edə, yük-yük qarşılıqlı təsirini optimallaşdırmaq üçün zülal şəbəkələrini yenidən təşkil edə və digər damcılarla qarşılıqlı əlaqədə ola bilər.səthlərlə (ıslatma).αS/pLK damcıları sadə zülal şəbəkəsi (yalnız αS və pLK arasında heterotipik qarşılıqlı təsirlər) və zülal-zülal qarşılıqlı təsirlərinə daha çox yaxınlıq sayəsində kondensatın yükünü daha tez tarazlaşdıra bilirlər;həqiqətən, biz αS/Tau ilə müqayisədə ilkin formalaşmış αS/pLK koaservatlarında daha sürətli protein kinetikasını müşahidə etdik.Valentlik azaldıqdan sonra qarşılıqlı təsirlər daha az efemer olur və damcılar maye xassələrini itirir və aşağı elektrostatik səth potensialına malik (və buna görə də səthi islatmaq iqtidarında olmayan) geləbənzər, alışmayan damcılara çevrilir.Bunun əksinə olaraq, αS/Tau damcıları daha mürəkkəb zülal şəbəkələri (həm homotipik, həm də heterotipik qarşılıqlı əlaqə ilə) və zülal qarşılıqlı təsirlərinin zəif təbiəti səbəbindən damcı yükü balansını optimallaşdırmaqda daha az effektivdir.Bu, maye davranışını uzun müddət saxlayan və yüksək elektrostatik səth potensialı nümayiş etdirən damcılarla nəticələnir ki, bu da birləşmə və böyümə (beləliklə, damcıların səth sahəsi/həcm nisbəti minimuma endirilir) və hidrofilik səth kimyasını islatmaqla minimuma endirilir.Bu, zülal şəbəkəsində yükün optimallaşdırılması üçün daimi axtarış sayəsində qarşılıqlı əlaqə çox keçici olaraq qaldığından, maye xüsusiyyətlərini saxlayan böyük konsentratlaşdırılmış protein kitabxanaları yaradır.Maraqlıdır ki, Tau-nun N-terminalla kəsilmiş formaları, o cümlədən bəzi təbii izoformlar62, ara davranış nümayiş etdirir, bəzi koaservatlar αS ilə qocalaraq uzunömürlü geləbənzər damlacıqlara, digərləri isə böyük maye kondensatlara çevrilir.αS elektrostatik koaservatların yetişməsindəki bu ikililik kondensatın ölçüsünə və mayenin xüsusiyyətlərinə nəzarət etmək üçün açar kimi kondensatlarda valentliyin azalması və elektrostatik süzülmə arasında korrelyasiya müəyyən edən son LLPS nəzəri və eksperimental tədqiqatlarına uyğundur.Mexanizm 58.61.
Bu sxem LLPS və LSPT vasitəsilə αS və Tau441 üçün ehtimal olunan amiloid aqreqasiya yolunu göstərir.Əlavə anionla zəngin (qırmızı) və kationla zəngin (mavi) bölgələrlə, qənaətbəxş valentliyə malik αS və tau elektrostatik koaservatlar daha az səth enerjisinə və buna görə də daha az birləşməyə malikdir, nəticədə damcıların sürətli qocalması ilə nəticələnir.Sabit qeyri-aglomerasiya gel vəziyyəti əldə edilir..Bu vəziyyət αS/pLK sistemi vəziyyətində çox əlverişlidir, çünki onun yüksək yaxınlığı və daha sadə zülal-cüt qarşılıqlı əlaqə şəbəkəsi sürətli geləbənzər keçidə imkan verir.Əksinə, qeyri-qənaətbəxş valentliyə malik damcılar və buna görə də qarşılıqlı təsir üçün mövcud olan zülal yüklü bölgələr, yüksək səth enerjisini azaltmaq üçün koaservatın hidrofilik səthi əritməsini və islamasını asanlaşdırır.Bu vəziyyət zəif Tau-Tau və αS-Tau qarşılıqlı təsirlərindən ibarət çoxvalentli kompleks şəbəkəyə malik olan αS/Tau441 koaservatları üçün üstünlük təşkil edir.Öz növbəsində, daha böyük koaservatlar maye kimi xassələrini daha asanlıqla saxlayacaq və digər zülal-zülal qarşılıqlı təsirlərinin baş verməsinə imkan verəcəkdir.Nəhayət, həm αS, həm də tau ehtiva edən amiloid heterojen aqreqatlar koaservat mayesinin içərisində əmələ gəlir ki, bu da neyrodegenerativ xəstəliklərin əlaməti olan inklüzyon cisimlərində olanlarla əlaqəli ola bilər.
Yüksək tıxaclı, lakin dinamik zülal mühiti və daha az dərəcədə αS/ΔNt-Tau koaservatları ilə αS/Tau441-in yetişməsi zamanı əmələ gələn böyük maye kimi strukturlar zülal birləşməsinin nüvələşməsi üçün ideal rezervuarlardır.Bu tip zülal koaservatlarında çox vaxt həm αS, həm də tau ehtiva edən bərk protein aqreqatlarının əmələ gəlməsini həqiqətən müşahidə etdik.Göstərdik ki, bu heteroaqreqatlar qeyri-elektrostatik qarşılıqlı təsirlərlə sabitləşir, amiloidə xas ThT boyalarını tipik amiloid fibrilləri ilə eyni şəkildə bağlaya bilir və həqiqətən də müxtəlif təsirlərə qarşı oxşar müqavimətə malikdir.LLPS tərəfindən yaradılmış αS/tau aqreqatlarının amiloid kimi xüsusiyyətlərə malik olduğu göstərilmişdir.Həqiqətən, amiloid birləşməsində çatışmazlığı olan Tau-nun yetkin variantı maye elektrostatik koaservat içərisində bu heterojen αS aqreqatlarının formalaşmasında əhəmiyyətli dərəcədə pozulur.αS/Tau441 aqreqatlarının əmələ gəlməsi yalnız maye kimi xassələri saxlayan koaservatların daxilində müşahidə olunub və əgər koaservatlar/damcılar gel vəziyyətinə çatmayıbsa, heç vaxt müşahidə olunmayıb.Sonuncu halda, elektrostatik qarşılıqlı təsirlərin artan gücü və nəticədə zülal şəbəkəsinin sərtliyi amiloid nüvəsi üçün zəruri olan yeni zülal qarşılıqlı əlaqə yaratmaq üçün zülalların zəruri konformativ yenidən qurulmasının qarşısını alır.Bununla belə, buna daha çevik, maye kimi koaservatlarda nail olmaq olar ki, bu da öz növbəsində ölçüləri artdıqca maye olaraq qalma ehtimalı daha yüksəkdir.
Kondensasiya olunmuş faza daxilində aqreqatların əmələ gəlməsinin böyük αS/Tau kondensatlarında sürətlə jelləşən kiçik damcılardan daha üstün olması faktı damcıların birləşməsinə nəzarət edən amillərin müəyyən edilməsinin aktuallığını vurğulayır.Beləliklə, nəinki fazaların ayrılması tendensiyası var, həm də kondensatın düzgün işləməsi, eləcə də xəstəliklərin qarşısının alınması üçün ölçüsünə nəzarət edilməlidir58,61.Nəticələrimiz həmçinin αS/Tau sistemi üçün LLPS və LSPT arasındakı tarazlığın vacibliyini vurğulayır.Damcı əmələ gəlməsi doyma şəraitində mövcud olan protein monomerlərinin miqdarını azaltmaqla amiloid birləşməsindən qoruya bilsə də, digər sistemlərdə təklif edildiyi kimi63,64, damcıların yüksək səviyyələrdə birləşməsi yavaş konformasiya yenidən təşkili ilə daxili zülal birləşməsinə səbəb ola bilər.protein şəbəkələri..
Ümumilikdə, məlumatlarımız LSPT kontekstində düşmə şəbəkələrində birləşmiş valentliyin və razı/qeyri-qənaətbəxş qarşılıqlı əlaqənin aktuallığını güclü şəkildə vurğulayır.Xüsusilə, biz göstəririk ki, tam uzunluqlu αS/Tau441 kondensatları həm zülalları özündə birləşdirən və eksperimental nəticələrimiz əsasında molekulyar mexanizm təklif edən amiloid kimi heteroaqreqatlar əmələ gətirmək üçün səmərəli şəkildə birləşməyə və nüvələşə bilir.Burada bildirdiyimiz αS/Tau maye koaservatında iki zülalın birgə birləşməsi həqiqətən xəstəliyin əlaməti olan inklüzyonlarda iki zülalın birgə lokalizasiyası ilə əlaqəli ola bilər və LLPS ilə amiloid aqreqasiyası, neyrodegenerasiyada yüksək yüklü İDP üçün yol açır.
Monomer WT-αS, sistein mutantları (Q24C-αS, N122C-αS) və ΔCt-αS variantları (Δ101-140) E. coli-də ifadə edilmiş və əvvəllər təsvir edildiyi kimi təmizlənmişdir.5 mM DTT disulfid bağının yaranmasının qarşısını almaq üçün αS sistein mutantlarının təmizlənməsinin bütün mərhələlərinə daxil edilmişdir.Tau441 izoformu (Adgene #16316-dan əldə edilmiş plazmid), ΔNt-Tau variantı (Δ1–150, IVA-nın CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC, G21purΔ1purΔpurΔTCu-variant ilə Agg71-5) primerləri ilə klonlanması ilə əldə edilmişdir. 5 primer) E. coli kulturaları idi 37 ° C və 180 rpm-də OD600 = 0,6-0,7-ə qədər böyüdü və ifadə 37 ° C-də 3 saat ərzində IPTG ilə induksiya edildi.4 °C-də 15 dəqiqə ərzində 11,500 xg-da məhsul hüceyrələri və 150 ​​mM NaCl olan salin buferi ilə yuyun.Peleti liziz tamponunda yenidən dayandırın (1 L LB üçün 20 ml: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine μM10p, μM10p).Sonikasiya addımı 10 impuls üçün 80% amplituda ilə buz üzərində aparıldı (1 dəq açıq, 1 dəq off).Bir ultrasəsdə 60 ml-dən çox olmamalıdır.E. coli lizatları 20 dəqiqə ərzində 95° C-də qızdırılıb, sonra buz üzərində soyudulub və 40 dəqiqə ərzində 127,000×g-də sentrifuqa edilib.Aydınlaşdırılmış supernatant 3,5 kDa membrana (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Böyük Britaniya) tətbiq olundu və 4 L dializ tamponuna (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2, DTTM 2 m) qarşı dializ edildi. , PMSF 0,1 mM) 10 saat ərzində.5 ml kation mübadiləsi sütunu (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, ABŞ) tarazlıq tamponu (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PMSF, 0.1) ilə tarazlaşdırıldı.Tau lizat 0,22 μm PVDF filtrindən süzüldü və 1 ml/dəq axın sürətində sütuna vuruldu.Elüsyon tədricən həyata keçirildi, tau 15-30% elüsyon tamponu (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF) ilə yuyuldu.Fraksiyalar SDS-PAGE ilə təhlil edildi və gözlənilən tau molekulyar çəkisi olan bir zolaqdan ibarət istənilən fraksiyalar 10 kDa sentrifuqa filtrindən istifadə edərək konsentrə edildi və 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM və DTT 2 mM olan buferlə əvəz edildi. son protein konsentrasiyası 100 μM idi.Daha sonra protein məhlulu 0,22 μm PVDF filtrindən keçirildi, tez donduruldu və -80°C-də saxlanıldı.Protein K18 nəzakətlə Prof. Alberto Boffi tərəfindən təmin edilmişdir.SDS-PAGE və MALDI-TOF/TOF tərəfindən təsdiq edildiyi kimi preparatın təmizliyi >95% təşkil etmişdir.Müxtəlif sisteinlər kimyəvi olaraq AlexaFluor488-maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ABŞ) və ya TEMPOL-maleimid (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada) ilə etiketlənmişdir.absorbsiya və MALDI-TOF/TOF ilə təsdiq edilmişdir.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau və K18 eyni prosedurdan sonra Atto647N-maleimid (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Almaniya) istifadə edərək 191 və 322 mövqelərində yerli sistein qalıqları ilə etiketlənmişdir.αS və Tau441 üçün qalıq başına xalis ödəniş xəritələri CIDER66 istifadə edərək yaradılıb.
Qatı poli-L-lizin (təchizatçı, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, ABŞ-dan NMR-ə uyğun olaraq pLK DP 90-110) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 ilə 10 mM konsentrasiyada həll edildi, proses 5 müddətində sonikasiya edildi. dəqiqə ultrasəs su banyosunda və -20 ° C-də saxlayın.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, ABŞ) və FITC-dekstran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, ABŞ) suda həll olunur və LLPS tamponunda geniş yayılmışdır.Dializ çirkləndirici duzları çıxarır.Daha sonra onlar məsamə ölçüsü 0,22 μm olan şpris filtrindən süzülüb və onların konsentrasiyası refraktometrdən istifadə etməklə hesablanıb (Mettler Toledo, Kolumbus, Ohayo, ABŞ).LLPS nümunələri otaq temperaturunda aşağıdakı ardıcıllıqla hazırlanmışdır: tampon və ekstruziya qarışdırılmış və 1 mM tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etan- 1, 2-diildinitril) tetraasetik turşu (EDTA, karboksint) və 1% proteaz inhibitorunun qarışığı (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptin 5 μM).Sonra αS və əridilmiş polikatyonlar (opsiya pLK və ya Tau) əlavə edilir.Tioflavin-T zaman seriyası təcrübələri üçün (ThT, Carbosynth, Compton, Böyük Britaniya) αS konsentrasiyasının yarısı olmaq üçün ümumi ThT konsentrasiyasını istifadə edin.Nümunələrin homojen olmasını təmin etmək üçün onları yumşaq, lakin hərtərəfli qarışdırın.Hər bir komponentin konsentrasiyası Nəticələr bölməsində təsvir olunduğu kimi təcrübədən təcrübəyə dəyişirdi.Təcrübə müddəti 4 saatdan çox olduqda azid 0,02% (v/v) konsentrasiyada istifadə edilmişdir.LLPS nümunələrindən istifadə edilən bütün analizlər üçün analizdən əvvəl qarışığın 5 dəqiqə tarazlaşmasına icazə verin.İşığın səpilmə analizi üçün 150 µl nümunə bağlayıcı olmayan 96 gözlü mikroplitələrə (µClear®, qara, F-Bottom/Chimney Quyusu, Greiner bio-one, Kremsmünster, Avstriya) yüklənmiş və yapışan filmlə örtülmüşdür.LLP-lər CLARIOstar boşqab oxuyucusunda (BMG Labtech, Ortenberg, Almaniya) məhlulun mərkəzində 350 nm-də absorbansın ölçülməsi yolu ilə monitorinq edildi.Təcrübələr üç nüsxədə 25°C temperaturda aparılıb və səhvlər orta göstəricidən standart kənarlaşma kimi hesablanıb.Seyreltilmiş faza nümunənin sentrifuqalanması və SDS-PAGE gel analizi ilə ölçüldü və seyreltilmiş və qatılaşdırılmış fazalardakı αS fraksiyasının miqdarı müxtəlif LLPS məhlullarında ölçüldü.Tərkibində 1 μM AF488 etiketli αS olan 100 μl LLPS nümunəsi hərtərəfli qarışdırıldıqdan sonra 30 dəqiqə ərzində 9600×g-də sentrifuqalama yolu ilə hazırlandı, bundan sonra çöküntü adətən görünürdü.Üst 50 μl supernatant SDS-PAGE gelindən istifadə edərək zülalın miqdarının təyini üçün istifadə edilmişdir.Gellər ChemiDoc gel görüntüləmə sistemindən (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ABŞ) istifadə edərək AF488 filtrləri ilə skan edildi və ya Coomassie ləkəsi ilə boyandı və müvafiq filtrlərlə vizuallaşdırıldı.Nəticədə lentlər ImageJ versiyası 1.53i (Milli Sağlamlıq İnstitutu, ABŞ) istifadə edərək təhlil edilmişdir.Təcrübələr oxşar nəticələrə malik iki fərqli təcrübədə iki nüsxədə aparılmışdır.
Tipik olaraq, 150 μl nümunə bağlayıcı olmayan 96 quyu mikroplitələrə tətbiq edildi və otaq temperaturunda Leica DMI6000B tərs mikroskopunda (Leica Microsystems, Wetzlar, Almaniya) vizuallaşdırıldı.Nöqtə təcrübələri üçün µ-Slide Angiogenesis lövhələri (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almaniya) və ya 96 quyulu polistirol mikroplitələr (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) də istifadə edilmişdir.İşıqlandırma mənbələri kimi EL6000 halogen və ya civə metal halid lampaları istifadə edilmişdir (müvafiq olaraq, BF/DIC və WF təsvirləri üçün).WF mikroskopiyası üçün işığı nümunəyə fokuslamaq və onu toplamaq üçün 40x böyüdücü hava obyektivi (Leica Microsystems, Almaniya) istifadə edilmişdir.AF488 və ThT etiketli nümunələr üçün standart GFP filtr dəstləri, həyəcanlandırma və emissiya diapazonu filtrləri, müvafiq olaraq, 460-500 nm və 512-542 nm bant keçirici filtrlər və 495 nm dikroik güzgü ilə həyəcanlandırma və emissiya filtri.Atto647N ilə etiketlənmiş nümunələr üçün, müvafiq olaraq 628-40 nm və 692-40 nm həyəcanlandırma və emissiya diapazonu filtrləri və 660 nm dikroik güzgü ilə standart Cy5 filtrləri dəsti istifadə edilmişdir.BF və DIC mikroskopiyası üçün eyni əks olunan işıq toplama obyektindən istifadə edin.Yığılan işıq Leica DFC7000 CCD kamerasında (Leica Microsystems, Almaniya) qeydə alınıb.Ekspozisiya müddəti BF və DIC mikroskop təsviri üçün 50 ms və WF mikroskopiya təsviri üçün 20-100 ms idi.Müqayisə üçün, ThT ilə bütün eksperimentlər üçün məruz qalma müddəti 100 ms idi.Damcıların birləşməsini vizuallaşdırmaq üçün vaxtaşırı təcrübələr aparıldı, şəkillər bir neçə dəqiqə ərzində hər 100 ms-dən bir toplandı.Təsvirin təhlili üçün ImageJ (NIH, ABŞ) istifadə edilmişdir.Təcrübələr oxşar nəticələrlə üç nüsxədə aparıldı.
Kolokalizasiya təcrübələri, FRAP və 3D rekonstruksiyası üçün şəkillər ZEN 2 mavi nəşrindən istifadə edərək Zeiss LSM 880 tərs konfokal mikroskopda əldə edilmişdir (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almaniya).50 µl nümunələr µ-Slide Angiogenesis Petri qablarına (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Almaniya) tətbiq olundu, hidrofilik polimerlə (ibiTreat) müalicə olundu və 63 × yağa batırma obyektivinə quraşdırıldı (Plan-Apochromat 63×il/NA 1.4) DIC-də).Şəkillər 458 nm, 488 nm və 633 nm arqon lazer xətlərindən istifadə edərək, 0,26 µm/piksel həlli və 470-600-36 nm2 həyəcan və emissiya aşkarlama pəncərələri üçün 8 µs/piksel ekspozisiya müddəti ilə əldə edilmişdir. və 638-755 nm müvafiq olaraq ThT, AF488 və Atto647N-i vizuallaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir.FRAP təcrübələri üçün hər bir nümunənin saniyədə 1 kadr sürətlə çəkilişi qeydə alınıb.Təcrübələr oxşar nəticələrlə otaq temperaturunda üç dəfə aparıldı.Bütün şəkillər Zen 2 mavi nəşr proqramından (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Almaniya) istifadə edilərək təhlil edilmişdir.FRAP əyriləri normallaşdırıldı, tərtib edildi və OriginPro 9.1 istifadə edərək Zen 2 istifadə edərək şəkillərdən çıxarılan intensivlik/zaman məlumatlarına uyğunlaşdırıldı.Bərpa əyriləri, əldə ağartma effektini hesablamaq üçün əlavə eksponensial terminlə molekulyar diffuziyanı hesablamaq üçün mono-eksponensial modelə uyğunlaşdırılmışdır.Daha sonra Kang və digərlərinin tənliyində olduğu kimi nominal ağartma radiusundan və əvvəllər müəyyən edilmiş bərpa yarı ömründən istifadə edərək D-ni hesabladıq.5 35 göstərilir.
αS-nin tək sistein variantları 24 (TEMPOL-24-αS) və 122 (TEMPOL-122-αS) mövqelərində 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksil (TEMPOL) ilə sintez edilmişdir. müvafiq olaraq.Spin Labeling EPR təcrübələri üçün αS konsentrasiyası 100 μM və PEG konsentrasiyası 15% (w/v) təşkil etmişdir.Müxtəlif aqreqasiya şərtləri üçün αS:pLK nisbəti 1:10, αS:ΔNt-Tau və αS:Tau441 nisbətləri isə 1:1 səviyyəsində saxlanıldı.Sıxlıq olmadıqda məcburi titrləmə təcrübələri üçün TEMPOL-122-αS 50 μM-də saxlanıldı və polikatyonlar artan konsentrasiyalarda titrləşdirildi, hər bir şərt ayrıca hazırlanır.CW-EPR ölçmələri ~9,7 GHz mikrodalğalı (SHF) tezliyində işləyən Bruker ER4118 SPT-N1 rezonatoru ilə təchiz edilmiş Bruker ELEXSYS E580 X-zolağı spektrometrindən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir.Temperatur 25 ° C-ə təyin edildi və maye azot kriostatı ilə idarə olundu.Spektrlər doymamış şəraitdə 4 mVt gücündə MVt, modulyasiya amplitudası 0,1 mT və modulyasiya tezliyi 100 kHz ilə əldə edilmişdir.Tərkibində Tau441 və ya ΔNt-Tau (orijinal zülal məhlullarında mövcuddur) olan nümunələrdə azaldıcı maddələrin qalıq konsentrasiyaları səbəbindən nümunələr arasında spin konsentrasiyalarında fərqlərin və mümkün spin azalmasının qarşısını almaq üçün spektral intensivliklər normallaşdırıldı.Verilmiş g qiymətləri Matlab®67-də həyata keçirilən Easyspin proqram təminatından (v. 6.0.0-dev.34) istifadə etməklə həyata keçirilən EPR spektral modelləşdirməsi nəticəsində əldə edilmişdir.Məlumatların modelləşdirilməsi üçün bir/iki komponentli izotrop modellərdən istifadə edilmişdir.Bütün siqnalları normallaşdırdıqdan sonra hər bir simulyasiyanı müvafiq eksperimental spektrdən çıxarmaqla qalıqlar hesablanmışdır.Bağlayıcı titrləmə analizi üçün, polikatyonların αS-ə bağlanmasına nəzarət etmək üçün normallaşdırılmış EPR spektrinin (III/III) ikinci zolağına üçüncü zolağın nisbi intensivliyindən istifadə edilmişdir.Dissosiasiya sabitini (Kd) qiymətləndirmək üçün əldə edilən əyri n eyni və müstəqil bağlanma yerini nəzərdə tutan təxmini modelə uyğunlaşdırıldı.
NMR spektroskopiyası təcrübələri krioprob və Z-qradiyenti ilə təchiz edilmiş Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR spektrometrindən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir.Bütün təcrübələr 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4-də 130-207 µM αS və müvafiq αS/ΔNt-Tau və pLK ekvivalentlərindən istifadə edilərək həyata keçirilib və 15°C-də aparılıb.LPS-i NMR ilə izləmək üçün əvvəlcədən qarışdırılmış nümunələrə 10% PEG əlavə edildi.Kimyəvi yerdəyişmənin pozulma qrafiki (şəkil 1b) orta 1H və 15N kimyəvi yerdəyişmələri göstərir.αS 2D1H-15N HSQC spektrləri əvvəlki təyinat əsasında təyin edilib (BMRB girişi #25227) və HNCA, HNCO və CBCAcoNH-nin 3D spektrlərinin qeydə alınması və təhlili ilə təsdiq edilib.13Cα və 13Cβ kimyəvi sürüşmələr ΔNt-Tau və ya pLK varlığında hesablanmışdır ki, təmiz təsadüfi rulon konformasiyasında αS kimyəvi sürüşmələri ilə müqayisədə ikincil struktur meyllərində mümkün dəyişiklikləri ölçmək 68 (Əlavə Şəkil 5c).R1ρ dərəcələri 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 və 800 ms gecikmələrlə hsqctretf3gpsi təcrübələrini (Bruker kitabxanasından əldə edilmiş) qeyd etməklə ölçüldü və eksponensial funksiyalar fərqli intensivlikdə pik gecikmələrə uyğunlaşdırıldı. R1ρ və onun eksperimental qeyri-müəyyənliyini təyin etmək üçün vaxt.
İki rəngli zamanla həll olunan flüoresan mikroskopiya təcrübələri, vaxtla əlaqəli tək foton sayma (TCSPC) cihazı ilə kommersiya vaxtı həll olunan MT200 flüoresan konfokal mikroskopda (PicoQuant, Berlin, Almaniya) həyata keçirildi.Lazer diod başlığı impulslu interleaved həyəcanlandırma (PIE) üçün istifadə olunur, şüa tək rejimli dalğa ötürücüsündən keçir və dikroik güzgüdən sonra ölçülmüş 481 nm və 637 nm lazer xətləri üçün 10 ilə 100 nVt lazer gücünə uyğunlaşdırılır.Bu, fotonun aliasing, fotoağartması və doyma təsirlərindən qaçaraq optimal foton sayma sürətini təmin edir.μ-Slayd angiogenez örtükləri və ya lövhələri (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almaniya) düzəldici yaxası olan Super Apochromat 60x NA 1.2 linzasının (Olympus Life Sciences, Waltham, ABŞ) üzərində birbaşa daldırma suyuna yerləşdirildi.Əsas şüa ayırıcı kimi 488/640 nm dikroik güzgüdən (Semrock, Lake Forest, IL, ABŞ) istifadə edilmişdir.Fokuslanmamış radiasiya 50 mikron diametrli bir çuxurla bağlanır, sonra fokuslanmış radiasiya 50/50 şüa ayırıcı ilə 2 aşkarlama yoluna bölünür.Detektorun qarşısında yaşıl boya üçün 520/35 (AF488) və qırmızı boya üçün 690/70 (Atto647N) bandpass emissiya filtrləri (Semrock, Lake Forest, IL, ABŞ) istifadə edilmişdir.Detektorlar kimi tək fotonlu uçqun diodlarından (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, İtaliya) istifadə edilmişdir.Həm məlumatların toplanması, həm də təhlili kommersiyada mövcud olan SymphoTime64 proqram təminatından (PicoQuant GmbH, Berlin, Almaniya) istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir.
μ-Slide angiogenez quyularına (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Almaniya) 50 mikrolitr LLPS nümunəsi tətbiq edilmişdir.Əldə edilən təsvirlər asılmış damcılar üçün optimal obyektiv iş məsafəsi üçün quyunun dibindən 20 µm yuxarıya, eksenel ayırdetmə qabiliyyəti ən azı 0,25 µm/piksel və gecikmə vaxtı 400 µs/piksel olan sallar və nöqtələr üçün ~1 µm-ə yönəldilir.Hər bir kanal üçün orta fon siqnal intensivliyinə (PBG, orta + 2σ) əsaslanan intensivlik həddini tətbiq etməklə məlumatları seçin ki, dispers fazadan hər hansı mümkün mənşəyi süzərək yalnız maye protein damcıları, sallar və ya ləkələr seçilsin.Hər bir kanalın hər növünün (τ) ömrünü (yaşıl, AF488 üçün “g” və qırmızı, Atto647N üçün “r”) təhlil etmək üçün damcı, sal və ya ləkələri olan maraq rayonlarını (ROI) seçdik (Əlavə Şəkil 1) ).8b) və quyruğa uyğunlaşma analizi və iki komponentli çürümə modelindən istifadə edərək, hər bir kanalda ömür boyu çürümələrini (damcılar, sallar və ya ləkələr üçün müvafiq olaraq τD, τR və τP, Əlavə Şəkil 8c-ə baxın) uyğunlaşdırmaqla onları əldə etdilər.τ-dən orta τ .Çox eksponensial uyğunluq üçün çox az foton istehsal edən ROI-lər analizdən çıxarıldı.İstifadə olunan kəsmə, sallar və nöqtələr üçün <104 foton və damcılar üçün 103 foton idi.Damcıların daha aşağı həddi var, çünki daha yüksək intensivlik dəyərlərinə malik çürümə əyrilərini əldə etmək çətindir, çünki şəkil sahəsindəki damcılar adətən daha kiçik və daha az olur.Fotonların toplanması limitindən yuxarı olan ROI-lər də analiz üçün atıldı.Minimum IRF müdaxiləsini təmin etmək və bütün intensivliyin tənəzzülü üçün eyniliyi saxlamaq üçün xidmət müddətinin əvvəlindən etibarən maraq bölgəsindən əldə edilən intensivliyin çürüməsi əyrisini maksimumun 90%-i intensivliklə (çürümənin maksimum intensivliyindən bir qədər sonra) uyğunlaşdırın. parametrlər Nisbi vaxt pəncərəsi Sallar və ləkələr üçün 25-50 ROI və damcılar üçün 15-25 ROI təhlil edildi, şəkillər ən azı 3 müstəqil təcrübədən qeydə alınmış 4-dən çox təkrardan seçildi.Növlər və ya koaservat sistemləri arasında statistik fərqləri qiymətləndirmək üçün iki quyruqlu t-testləri istifadə edilmişdir.Ömrü (τ) üzrə piksel-piksel təhlili üçün hər bir kanal üçün sahə üzrə ömür müddətinin ümumi zəifləməsi hesablanmış və 2/3 komponentli eksponensial zəifləmə modelinin təxmini hesablanması aparılmışdır.Daha sonra hər bir piksel üçün ömür boyu zəifləmə əvvəllər hesablanmış τ dəyərlərindən istifadə etməklə quraşdırıldı, nəticədə yalançı rəngli FLIM uyğun şəkli yarandı.Quyruq uyğunluğu ömür diapazonu eyni kanalın bütün şəkillərində eyni idi və hər çürümə etibarlı uyğunluğu təmin etmək üçün kifayət qədər foton istehsal etdi.FRET analizi üçün piksellər 11 fotonun fon siqnalını (FBG) orta hesabla verən 100 fotondan daha aşağı intensivlik həddini tətbiq etməklə seçilmişdir.Hər bir kanalın flüoresans intensivliyi eksperimental olaraq müəyyən edilmiş korreksiya faktorları ilə korreksiya edilmişdir: 69 spektral çarpaz α 0,004, birbaşa həyəcan β 0,0305, aşkarlama effektivliyi γ 0,517 idi.Piksel səviyyəsində FRET səmərəliliyi daha sonra aşağıdakı tənlikdən istifadə edərək hesablanır:
burada FDD donor (yaşıl) kanalda müşahidə olunan flüoresan intensivliyidir, FDA dolayı həyəcanlanma altında akseptor (qırmızı) kanalda müşahidə olunan flüoresans intensivliyidir və FAA birbaşa həyəcanlandırma altında akseptor (qırmızı) kanalda müşahidə olunan flüoresan intensivliyidir ( PIE).Kanalda flüoresan intensivlik impulsları müşahidə olunur).
25 µM etiketsiz monomerik Tau441 (25 µM αS ilə və ya onsuz) olan 100 µl LLPS reaksiya məhlulunu LLPS tamponuna (yuxarıda göstərildiyi kimi əlavə olunur) yapışan folqa örtüyü ilə bağlanmayan 96 quyulu mikroplitələrə qoyun və damcı əmələ gəlməsi WF mikroskopi ilə yoxlanıldıqdan sonra tarazlıq.10 dəqiqə ərzində.Otaq temperaturunda 48 saat inkubasiyadan sonra zülal salları və ləkələrinin olması təsdiqləndi.Sonra quyulardan salların üzərindəki mayeni diqqətlə çıxarın, sonra 50 L dissosiasiya tamponu (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) əlavə edin və 10 dəqiqə inkubasiya edin.Yüksək duz konsentrasiyası LLPS-nin qalıq PEG səbəbiylə təkrarlanmamasını təmin edir və yalnız elektrostatik qarşılıqlı təsir nəticəsində yaranan mümkün protein birləşmələri söküləcəkdir.Quyunun dibi daha sonra mikropipetin ucu ilə diqqətlə sıyrıldı və nəticədə alınan məhlul boş müşahidə quyusuna köçürüldü.Nümunələrin 1 saat ərzində 50 μM ThT ilə inkubasiyasından sonra, təcrid olunmuş ləkələrin olması WF mikroskopiyası ilə yoxlanıldı.PBS-də 300 µl 70 µM αS məhlulunu pH 7,4, natrium azid 0,01% 37 °C-də və 200 rpm-də orbital çalkalayıcıda 7 gün inkubasiya etməklə sonik αS fibrillərini hazırlayın.Sonra məhlul 30 dəqiqə ərzində 9600 × g-də sentrifuqa edildi, pellet PBS pH 7.4-də yenidən dayandırıldı və sonikasiya edildi (Vibra-Cell VC130 sonikatorunda 1 dəqiqə, 50% dövr, 80% amplituda, Sonics, Nyuton, ABŞ) fibril nümunələri kiçik fibrillərin nisbətən vahid ölçülü paylanması ilə.
FCS/FCCS analizi və iki rəngli təsadüfün aşkarlanması (TCCD) PIE rejimindən istifadə edərək FLIM-FRET mikroskopiya təcrübələri üçün istifadə edilən eyni MT200 zamanla həll olunan flüoresan konfokal mikroskopda (Pico-Quant, Berlin, Almaniya) həyata keçirildi.Bu təcrübələr üçün lazer gücü 6.0 µW (481 nm) və 6.2 µW (637 nm) əlavə edildi.Bu lazer güclərinin birləşməsi optimal sayma sürətinə nail olmaq və fotoağartma və doyma hallarına yol verməmək üçün istifadə edilən flüorofor cütləri üçün oxşar parlaqlıq yaratmaq üçün seçilmişdir.Həm məlumatların toplanması, həm də təhlili kommersiyada mövcud olan SymphoTime64 versiyası 2.3 proqram təminatından (PicoQuant, Berlin, Almaniya) istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir.
LLPS istifadə edərək əldə edilmiş təcrid olunmuş αS/Tau aqreqatlarının nümunələri müvafiq monomolekulyar konsentrasiyaya (adətən 1:500 seyreltmə), çünki koaservat nümunələrindən təcrid olunduqda aqreqatlar artıq aşağı konsentrasiyalarda olduğu üçün izolyasiya buferində seyreltilir.Nümunələr birbaşa olaraq 1 mq/mL konsentrasiyada BSA məhlulu ilə əvvəlcədən örtülmüş örtüklərə (Korninq, ABŞ) tətbiq edilmişdir.
Yaşıl və qırmızı kanallarda PIE-smFRET analizi üçün monomerik hadisələrin yaratdığı aşağı intensivlikli siqnalları süzmək üçün 25 fotondan ibarət daha aşağı intensivlik həddi tətbiq edildi (qeyd edək ki, monomerlər təcrid olunmuş aqreqatlarla müqayisədə yığılmış nümunələrdən çoxdur).Bu həddi analiz üçün aqreqatları xüsusi seçmək üçün təmiz monomer nümunələrinin təhlilindən əldə edilən monomer αS-nin orta intensivliyinin beş misli kimi hesablanmışdır.PIE sürücü sxemi, TSCPC məlumatlarının toplanması ilə birlikdə, fon və spektral çarpazlığı aradan qaldırmağa kömək edən ömür boyu ölçmə filtrinin tətbiqinə imkan verdi.Yuxarıdakı həddlərdən istifadə etməklə seçilmiş məşəl intensivliyi yalnız tampon nümunələrinin intensivliyinə/binliyinə qarşı baş vermə histoqramlarından müəyyən edilmiş orta fon siqnalından istifadə etməklə düzəldilmişdir.Böyük aqreqatlarla əlaqəli partlamalar adətən vaxt izində bir neçə ardıcıl qutu tutur (1 ms olaraq təyin olunur).Bu hallarda maksimum gücü olan bir qutu seçildi.FRET və stoxiometrik analiz üçün nəzəri cəhətdən müəyyən edilmiş qamma faktoru γ (0,517) istifadə edilmişdir.Spektral çarpışma və birbaşa həyəcan töhfələri istifadə olunan həyəcanlandırma lazer gücündə əhəmiyyətsizdir (eksperimental olaraq müəyyən edilir).Partlayışda FRET-in səmərəliliyi və stoxiometriyası aşağıdakı kimi hesablanır.