310 10*1mm Paslanmayan poladdan bükülmüş boru kimyəvi komponenti, Spidroinin N-terminal domenləri amiloid fibrillərə əsaslanan hidrogellər əmələ gətirir və zülalın immobilizasiyası üçün platforma təmin edir.

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.
Hər slaydda üç məqalə göstərən slayderlər.Slaydlar arasında hərəkət etmək üçün geri və sonrakı düymələrdən və ya hər slaydda hərəkət etmək üçün sonundakı slayd nəzarətçi düymələrindən istifadə edin.

Spesifikasiya

310 10*1mm Paslanmayan poladdan bükülmüş boru təchizatçıları

Kimyəvi birləşmə

Mexaniki xüsusiyyətləri

Rekombinant hörümçək ipək zülalları (hörümçək ipək zülalları) yeni biomaterialların hazırlanmasında bir çox potensial tətbiqlərə malikdir, lakin onların multimodal və aqreqasiyaya meylli təbiəti onları əldə etməyi çətinləşdirir və istifadəsini asanlaşdırır.Burada rekombinant miniatür spidroin zülallarının və ən əsası N-terminal domeninin (NT) özünün 37 °C-də sürətlə özünü dəstəkləyən və şəffaf hidrogellər əmələ gətirdiyini bildiririk.NT və yaşıl flüoresan zülaldan və ya purin nukleosid fosforilazdan ibarət füzyon zülalları tam funksional füzyon zülalları əmələ gətirir.Hidrojellər.Nəticələrimiz göstərir ki, rekombinant NT və füzyon zülalları yüksək ifadə məhsuldarlığı təmin edir və hidrogellərə şəffaflıq, çarpazlaşmadan gelləşmə və aktiv zülalların yüksək sıxlıqda birbaşa immobilizasiyası kimi cəlbedici xüsusiyyətlər bəxş edir.
Hörümçəklərin hər biri müəyyən bir ipək növü istehsal edən yeddi fərqli ipək vəzi dəsti var.Yeddi ipək növünün hamısı uzunluğu təxminən 6000 qalıq olan hörümçək ipək zülallarından (spidroinlərdən) ibarətdir və sferik N- və C-terminal domenləri (NT və CT) ilə əhatə olunmuş böyük mərkəzi təkrar bölgəni ehtiva edir1,2.Ən çox öyrənilən ipək növü, ilkin ampulla, ilkin ampulla vəzi tərəfindən istehsal olunur.Bu vəzidə epitel hüceyrələrinin bir təbəqəsi spidroin zülallarını sintez edir və onları vəzin lümeninə ifraz edir, burada onlar həll olunan formada (dopinq) olduqca yüksək konsentrasiyalarda (30-50% w/v) olur3,4.Vəzdəki əsas ampulyar spidroin zülallarının təşkili və konformasiyası müzakirə edilmişdir, lakin eksperimental sübutların əksəriyyəti ümumiyyətlə spiral və/yaxud təsadüfi spiral konformasiyanın və miselyar və ya qatlı strukturların mövcudluğunu göstərir5,6,7,8,9,10.Təkrarlanan domenlər ipək liflərinin mexaniki xassələrini tənzimləyərək, β-yaşaq nanokristalları və amorf strukturları11,12,13,14,15, son domenlər isə ipək vəzi boyunca dəyişən şərtlərə cavab olaraq ipək liflərini tənzimləyir16,17,18.İpək əmələ gəlməsinə nəzarət etməklə, 19. Terminal sahələr təkamüllə qorunur və onların funksiyası bütün spidroin zülalları üçün ümumi ola bilər 2,20,21.Vəzidən keçərkən, spidroinin pH-ı təxminən 7.6-dan < 5.716-a qədər azalır və tədricən daralmış kanal vasitəsilə hərəkətin vasitəçiliyi ilə kəsilmə və uzanma ilə artır.Məhlulda CT α-sarmal konstitutiv paralel dimerdir17, lakin aşağı pH və kəsmə qüvvələrinə cavab olaraq CT açılır və β-qatları16, 17-ni dəyişdirir, ola bilsin ki, Convert 16-nın təkrarlanan bölgələrində β-qatları tetikler. NT monomerdir. vəzinin lümenindəki şərtləri əks etdirən şərtlər və spidroinin həllinə vasitəçilik edir, lakin aşağı pH-da bir sıra karboksilik turşu yan zəncirlərinin protonasiyası təxminən 6,5 pKa ilə NT-nin dimerləşməsinə gətirib çıxarır, bununla da NT-ni sabitləşdirir və spidroini böyük ölçüdə sabitləşdirir. miqdarlar.şəbəkələr16,18.Beləliklə, NT örtükdəki monomerdən lifdəki dimere çevrilərək filamentin formalaşmasında əsas rol oynayır23,24,25.NT bu günə qədər tədqiq edilmiş bütün şərtlərdə yüksək dərəcədə həll olunan və spiral olaraq qalır16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, bu da onun heteroloji zülalların istehsalı üçün həllolma qabiliyyətini artıran etiket kimi inkişafına ilham verdi.
Bir NT, bir qısa təkrar bölgə, bir CT və təmizlənmə üçün His6 etiketindən (His-NT2RepCT) ibarət rekombinant mini hörümçək ipək zülalı yerli hörümçək ipək zülalı kimi sulu tamponda həll olunur və ipək hörümçəyin yerli vacib xüsusiyyətlərini təqlid edir. .əhatə 25.31.His-NT2RepCT, pH 8 həll olunan örtükün pH 525,32,33,34,35 su banyosuna ekstrüde edildiyi biomimetik maşından istifadə edərək davamlı liflərə çevrilə bilər.His-NT2RepCT ifadə edən E. coli-nin bioreaktor fermentasiyası və sonrakı müalicə təmizlənmədən sonra >14 q/L məhsulla nəticələndi.His-NT2RepCT-nin yüksək məhsuldarlığı, yüksək həllolma qabiliyyəti və asidik şəraitə adekvat reaksiyası NT23, 25, 34-ə aid edilir.
Burada 37 °C-də bir zülal məhlulunu inkubasiya etməklə, tək NT daxil olmaqla, rekombinant spidroin zülallarından şəffaf hidrogellərin sürətli formalaşması haqqında məlumat veririk.Tioflavin T flüoresansı (ThT), Furye transformasiya edən infraqırmızı spektroskopiya (FTIR), nüvə maqnit rezonans spektroskopiyası (NMR) və ötürücü elektron mikroskopiyasından (TEM) istifadə edərək, NT və mikrohörümçək zülallarının β təbəqələrə və amiloidlərə bənzər fibrillərə struktur transformasiyasına məruz qaldığını aşkar etdik. gellər əmələ gəldikdə.Bundan əlavə, NT və yaşıl flüoresan zülalın (GFP) və ya purin nukleosid fosforilazının (PNP) birləşmə zülalları tam funksional füzyon fraqmentləri olan hidrogellər əmələ gətirir.Fizioloji şəraitdə hidrogellərin sürətli formalaşması ilə birləşən heteroloji sahiblərdə yüksək məhsuldarlıq ifadəsi, mühəndis funksiyaları olan hidrogellərin iqtisadi cəhətdən səmərəli istehsalı imkanlarını açır.
Əksər bildirilən rekombinant spidroin zülallarından fərqli olaraq36, His-NT2RepCT Tris-HCl tamponunda pH 8-də sabitdir və çökmə olmadan 500 mq/mL-ə qədər konsentrasiya edilə bilər25.Buna görə də, biz təəccübləndik ki, bu zülal 37°C-də inkubasiya edildikdə sürətlə optik cəhətdən şəffaf, öz-özünə dəstəklənən hidrogellər əmələ gətirir (şəkil 1b-d).Sonrakı tədqiqatlar göstərdi ki, His-NT2RepCT gelləşməsi zülal konsentrasiyalarının geniş diapazonunda (10-300 mq/mL) baş verir və bu konsentrasiya jelləşmə vaxtı ilə tərs korrelyasiya olunur (Şəkil 1c və Əlavə Şəkil 1).His-NT2RepCT-nin hansı hissələrinin hidrogel əmələ gəlməsinə vasitəçilik etdiyini öyrənmək üçün, sonra biz hər bir domeni ayrı-ayrılıqda və flakon inversiya analizindən istifadə edərək müxtəlif kombinasiyalarda araşdırdıq (Şəkil 1a,b).Rekombinant spidroinin bütün sınaqdan keçirilmiş fraksiyaları çökdürülmüş 2Rep istisna olmaqla, 1 saatdan az müddətdə (300 mq/ml zülal konsentrasiyasında) gel əmələ gətirdi (Şəkil 1b).Bu, tək NT və CT-nin kombinasiyada və ya təkrarlarla əlaqəli olduğunu göstərir ki, 37°C-də gelləşə bilər və His6 etiketi bu prosesə əhəmiyyətli dərəcədə təsir etmir.NT-nin yüksək dərəcədə həll olunan və dayanıqlı bir zülal olduğu və rekombinant spidroin hidrogellərinin əvvəlki hesabatlarında təkrar bölgələrdə və/və ya KT-lərdəki konformasiya dəyişiklikləri ilə gelasiya effektləri ilə bağlı ümumi anlayışı nəzərə alsaq, NT-nin özü ola bilər.Jelləşmənin kəşfi gözlənilməz oldu.Əlavə Cədvəl 1) 37, 38, 39. Maraqlıdır ki, NT ≥ 300 mq/mL konsentrasiyada artıq 10 dəqiqə ərzində gelləşmişdir (Şəkil 1c).Müxtəlif konsentrasiyalarda NT ilə flakon inversiya təcrübələri göstərdi ki, >50 mq/mL-də NT məhlulu müvafiq konsentrasiyada His-NT2RepCT-dən daha sürətli gelləşir (ağırlıq/v, Şəkil 1c).
Bu işdə tədqiq edilən müxtəlif spidroin konstruksiyalarının sxematik təsviri.b Müxtəlif rekombinant spidroin zülalları (300 mq/mL) üçün 37 °C-də gel vaxtı flakonun çevrilməsi ilə təsdiqlənir.Dərhal inkubasiya olmadan CT gel (<300 mq/mL), 2Rep çöküntüləri (300 mg/mL, 5 mm miqyasda).c 37°C-də göstərilən protein konsentrasiyalarında His-NT2RepCT və NT-nin gel vaxtı.d Hörümçək və altında müvafiq olaraq “NT” hərfi olan His-NT2RepCT və NT hidrogellərinin fotoşəkilləri (hər ikisi 200 mq/mL, miqyas çubuğu 5 mm).
Müxtəlif rekombinant spidroin zülallarından əmələ gələn hidrogellər bir qədər fərqli rənglərə malikdir və çılpaq gözlə müşahidə müxtəlif şəffaflıq dərəcələrini göstərir (şəkil 1b).NT gelləri olduqca şəffafdır, digər gellər isə qeyri-şəffaf olur.Silindrik borulara tökülən His-NT2RepCT və NT gelləri bütöv şəkildə qəlibdən çıxarıla bilər (Şəkil 1d).
Təbii hörümçək ipək örtüklərinin indi rekombinant spidroin zülallarının gelləşməsinə səbəb olub-olmadığını yoxlamaq üçün İsveç körpü hörümçəkinin (Larinioides sclopetarius) böyük ampul vəzisindən örtüklər toplanmışdır.Kaplamalar 20 mM Tris-HCl tamponunda 50 mq/mL (ölçülmüş quru çəki əsasında) saxlanıldı, lakin 37 °C-də 21 günlük inkubasiya zamanı jelləşmə müşahidə edilmədi (Əlavə Şəkil 2a).
Bu gellərin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün gelləşmə prosesini öyrənmək və ümumi mexaniki xüsusiyyətləri müəyyən etmək üçün reoloji ölçmələrdən istifadə etmək olar.Xüsusilə, yüksək temperaturda saxlama modulunun (elastikliyin) monitorinqi gelləşmə temperaturu, eləcə də örtünün özlü-elastik xüsusiyyətləri haqqında məlumat verə bilər.Temperaturun yüksəldilməsi təcrübələri (25-45°C-də 1°C/dəq istifadə edərək, təbii ipək məhlullarından istifadə edilən əvvəlki tədqiqatlara əsaslanaraq)40,41 göstərdi ki, His-NT2RepCT və NT məhlullarının saxlama modulları artan temperaturla artıb.artırıldı (Şəkil 2 və Əlavə Şəkil 3).Qeyd edək ki, NT modulu His-NT2RepCT ilə müqayisədə daha aşağı temperaturda böyüməyə başladı, bu da NT birbaşa His-NT2RepCT ilə 37°C-də inkubasiya edildikdə müşahidə olunan daha sürətli gel müddətinə uyğundur (Şəkil 1).Temperaturun sonrakı düşməsindən sonra saxlama modulu aşağı dəyərlərə qayıtmadı və itki modulundan yuxarı qaldı (Əlavə Şəkil 3-ə baxın), bu, termal olaraq geri dönməz sabit jelləşməni göstərir.Jelləşmədən sonra son elastik modul His-NT2RepCT hidrojelləri üçün 100-500 mq/mL konsentrasiyada 15 ilə 330 kPa, NT hidrogelləri (100-500 mq/mL) üçün son elastik modul isə 2 ilə 1400 arasında dəyişdi. kPa (Şəkil, 2 və tam eniş məlumatları) Əlavə Şəkil 3-ə baxın).
a His-NT2RepCT (300 mq/mL) və b NT (300 mq/mL) silkələnmə ilə ölçülməsi zamanı temperaturun dəyişməsi.Oklar temperatur tendensiyasını göstərir və saxlama modulu məlumatlarının daha yüngül kölgəsi, artan səs-küyün səbəbi olan istehsalçı tərəfindən göstəriləndən daha aşağı fırlanma momenti dəyərlərində cihaz üçün sınaqları təsvir edir.c Yüksək temperaturdan (100, 300 və 500 mq/mL) sonra His-NT2RepCT və NT-nin son modulda yığılması.Bütün modul oxunuşları 0,1 Hz tezliyində götürülür.
Gelləşmə ilə əlaqəli konformasiya dəyişikliklərini araşdırmaq üçün potensial bir üsul olaraq, 37 ° C-də jelləşmədən əvvəl və sonra His-NT2RepCT və NT-nin FTIR spektrlərini qeyd etdik (Şəkil 3a, b).Gözlənildiyi kimi, His-NT2RepCT və NT məhlullarının spektrləri 1645 sm-1-də aydın zolaqla α-heliks/təsadüfi qıvrım ikincil strukturunu göstərən zülallara uyğundur.Hər iki hidrogel üçün gelləşmə, orta I zolaqda təxminən 1617 sm-1 və 1695 sm-1-də iki qolun meydana gəlməsi ilə nəticələndi (Şəkil 3a, b), bu, antiparalel β-yaşaq strukturlarının formalaşmasını göstərir.Bu dəyişiklikləri müvafiq ikinci törəmə və fərqli gelasiya spektrlərində də aydın görmək olar (Əlavə Şəkil 4b).NT β-qatının iki zolağı His-NT2RepCT-dən daha aydın idi, bu onu göstərir ki, NT hidrogelindəki β-qat zolaqlarının ümumi tərkibi NT2RepCT hidrogelindən daha yüksəkdir.
His-NT2RepCT və b NT (hər ikisi 500 mq/mL) 37°C-də inkubasiyadan əvvəl (məhluldan) və sonra (gel) FTIR udma spektrləri.c Yenidən dayandırılmış 50 mq/ml NT2RepCT gellərinin TEM şəkilləri və d NT.Ölçək çubuğu 200 nm.e His-NT2RepCT və NT hidrogellərinin lif diametrləri.n = 100 ölçülən fibril, p <0,0001.Səhv çubuqları standart sapmanı göstərir.Səhv çubuqlarının mərkəzi ortadır.Statistik təhlil üçün qoşalaşdırılmamış t-testi (iki quyruqlu) istifadə edilmişdir.f Müxtəlif rekombinant spidroin zülallarının (100 mq/mL) 37 °C-də titrəmədən ThT floresansı.g NT (100 mq/mL) 0%, 5%, 10% və 20% toxumlarla 100 mq/mL NT gelindən aşılama təcrübələri.
Transmissiya elektron mikroskopiyasından (TEM) istifadə edərək gelin təhlili göstərdi ki, hidrogel amiloidabənzər fibrillərdən ibarətdir (şək. 3c, 3d).NT- əmələ gətirən fibrillər uzunsov (diametri 5-12 nm) və budaqsız idi, His-NT2RepCT fibrilləri isə daha qısa uzunluqda və diametri əhəmiyyətli dərəcədə geniş idi (7-16 nm) (Şəkil 3e).Bu nəticələr bizə tioflavin T (ThT) analizindən istifadə edərək fibrozun kinetikasını izləməyə imkan verdi.Bütün rekombinant spidroin zülalları üçün nümunələr 37 °C-də inkubasiya edildikdə flüoresan siqnal artdı (Şəkil 3f, Əlavə Şəkil 5a).Bu tapıntıya uyğun olaraq, jelləşmə şəraitində NT və His-NT2RepCT-nin mikroskopik müayinəsi ThT-müsbət aqreqatların nəzərəçarpacaq dərəcədə yerli yığılması olmadan ThT floresansında vahid artım aşkar etdi (Əlavə Şəkil 5b, c).ThT-müsbət fibrillərin formalaşması NT və His-NTCT bulanıqlığının artması ilə müşayiət olunmadı (Əlavə Şəkil 5d), bu o deməkdir ki, geldəki fibrillər şəbəkəsi gel şəffaflığına xələl gətirmədən yarana bilər.Az miqdarda əvvəlcədən əmələ gəlmiş fibrillərin əlavə edilməsi ilə toxum əkilməsi bəzi amiloidlərin fibril əmələ gəlməsini əhəmiyyətli dərəcədə sürətləndirə bilər42,43,44 lakin NT hidrokoaqulyantlarının məhluluna 5%, 10% və ya 20% (ağırlıq/ağırlıq) NT əlavə etməklə.toxumçuluq effekti (Şəkil 3g).Bəlkə də bu, hidrogeldəki fibrillərin nisbətən sabit olması və toxum kimi istifadə edilə bilməməsi ilə bağlıdır.
Rekombinant spidroin zülallarının yüksək temperaturda gözlənilməz davranışı gel əmələ gəlməsi ilə əlaqəli konformasiya dəyişikliklərini müəyyən etmək üçün əlavə nüvə maqnit rezonans (NMR) spektroskopiya tədqiqatlarına təkan verdi.Zamanla 37°C-də qeydə alınan His-NT2RepCT məhlullarının NMR spektrləri CT-nin hələ də qismən qatlanmış olduğunu, NT və 2Rep siqnallarının isə yoxa çıxdığını göstərdi (Şəkil 4a), onun əsasən His-NT2Rep-in formalaşmasını qismən idarə edən NT və 2Rep olduğunu göstərir. NT2RepCT hidrogel.CT siqnalı da orijinal intensivliyinin 20%-nə qədər zəiflədi, bu da CT-nin də əsasən sabit olduğunu və hidrogel strukturuna daxil edildiyini göstərir.Əvvəlcədən inkubasiya edilmiş nümunədəki kimi mobil olan və beləliklə NMR məhlulu ilə müşahidə edilən KT-nin daha kiçik bir hissəsi üçün spektrlərdə ilk 10 strukturlaşdırılmış qalıq üçün siqnal yoxdur, ola bilsin ki, His-NT2Rep-in əlavə hissəsinin çətin immobilizasiyası səbəbindən.-NT2RepCT-nin hidrogellərin vəziyyətinin NMR spektrləri α-spiralların və β-qatlarının üstünlük təşkil etdiyini və daha az dərəcədə təsadüfi bobin uyğunluğunu aşkar etdi (Şəkil 4b).Yalnız NT-də mövcud olan metionin qalıqlarının kimyəvi sürüşmə təhlili göstərdi ki, bu sahə β-vərəq strukturuna çevrilmişdir.Məhlulda NT-nin zamandan asılı spektrləri siqnal intensivliyində vahid azalma göstərdi (şək. 4c), NT hidrogellərinin bərk hallı NMR-si isə NT qalıqlarının çoxunun β-vərəq strukturlarına çevrildiyini göstərdi (şəkil 4d).2Rep-in uyğunluğu cəmləşmə meylinə görə ayrıca müəyyən edilə bilmədi.Bununla belə, NTCT və His-NT2RepCT hidrogellərinin bərk hallı NMR spektrləri çox oxşar görünürdü (Şəkil 4b; Əlavə Şəkil 6b), 2Rep-in His-NT2RepCT hidrogelinin struktur hissəsinə az töhfə verdiyini göstərir.CT hidrogelləri üçün α-spirallar, β-vərəqlər və təsadüfi spiral ikincil strukturların mövcud olduğu aşkar edilmişdir (Əlavə Şəkil 6d).Bu onu göstərir ki, KT-nin bəzi hissələri α-spiral şəklində qalır, digərləri isə β-vərəqlərə çevrilir.Beləliklə, NMR spektroskopiyasının nəticələri göstərir ki, NT hidrogel əmələ gəlməsi üçün vacibdir və eyni zamanda 2Rep və CT ilə birləşmə zamanı β-vərəq konformasiyasına çevrilir.Buna uyğun olaraq, biz bu yaxınlarda tapdıq ki, amiloid məkan fermuarları ehtimal ki, NT domeninin bütün beş spiralında əmələ gəlir və Vals alqoritmi 1-ci sarmalda amiloidogen bölgəni proqnozlaşdırır (Şəkil 4e).
37°C-də inkubasiyadan əvvəl (mavi) və 19 saat sonra (qırmızı) 15N-HSQC 10 mq/mL His-NT2RepCT məhlulunun 2D spektrləri.Qırmızı spektrdə fərdi çarpaz zirvələr və mavi spektrdə F24, G136, polyA tək hərfli amin turşusu simvolları və qalıq nömrələri ilə işarələnir.Əlavələr NT, 2Rep və CT domenlərindən seçilmiş qalıqlar üçün siqnal intensivliyinin vaxtından asılılığını göstərir.b His-NT2RepCT hidrogellərinin bərk hallı radiotezlik (RFDR) spektrləri.RFDR spektrlərində müşahidə edilən Cα/Cβ qalıqlarının korrelyasiyaları model peptid kimyəvi sürüşmələri və statistikadan əldə edilən qiymətlərlə müqayisə edilərək müəyyən edilmişdir82,83 və onların ikinci dərəcəli strukturları.SSB - fırlanan yan zolaq.c 37 °C-də 36 saat ərzində inkubasiya zamanı 15N-HSQC 10 mq/mL NT məhlulunun birölçülü spektrləri.İçəridə zamana qarşı həcm intensivliyi göstərilir.d NT hidrogellərinin bərk hallı RFDR spektrləri.RFDR spektrlərində müşahidə olunan Ca/Cβ qalıqlarının və onların ikinci dərəcəli strukturlarının korrelyasiyaları göstərilmişdir.e Fermuar verilənlər bazasından (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 fibrilasiya meyli profilinə əsaslanır.Hexapeptidin məkan ildırım dəyişmə pəncərəsinin Rosetta enerjisi kkal/mol ilə göstərilmişdir.Qırmızı çubuqlar yüksək fibroza meylli hexapeptidləri ifadə edir (Rozetta enerjisi -23 kkal/mol-dan aşağı; nöqtəli xəttin altında).Yaşıl çubuqlar Rosetta enerjiləri eşikdən yuxarı olan fraqmentləri göstərir və buna görə də sterik fermuarların əmələ gəlməsi ehtimalı azdır.Tərkibində prolin olan fraqmentlər analizdən (sütunsuz) çıxarılıb.Kvadratlar Vals alqoritmi81 (https://waltz.switchlab.org) tərəfindən proqnozlaşdırılan amiloidoz sahələrini göstərir.NT-nin amin turşusu qalıqlarının ardıcıllığı yuxarıdadır və β ikincili strukturda aşkar olunan qalıqların növləri (bərk vəziyyətdə NMR spektroskopiyası ilə müəyyən edilir) qırmızı rənglə göstərilir.Beş NT α-spiralının mövqeləri (H1-H5)28 kimi təyin edilmişdir.
pH <6,5-də HT dimerləşir, istilik və ya karbamidin səbəb olduğu denaturasiyaya davamlıdır18.NT-nin dimerləşməsinin və stabilliyinin jelləşməyə necə təsir etdiyini aydınlaşdırmaq üçün 100 mq/ml NT tərkibli məhlullar flakon inversiya testindən istifadə edərək pH 8, 7 və 6-da nəzarət edildi.pH 8 və 7-də inkubasiya edilmiş NT nümunələri 37 °C-də 30 dəqiqədən sonra gelləşdi, lakin pH 8 gel şəffaf qaldı, pH 7 gel isə görünən çöküntü göstərdi (Şəkil 5a).Bunun əksinə olaraq, pH 6-da HT olan məhlul gel əmələ gətirmədi və 37°C-də 20 dəqiqədən sonra böyük bir çöküntü göründü.Bu onu göstərir ki, dimerlərin özləri və/və ya monomerlərlə müqayisədə daha yüksək stabilliyi gelləşmənin qarşısını alır.NT üçün çöküntünün pH 7 və 6-da əmələ gəlməsi gözlənilmirdi, çünki NT-nin 200 mq/ml27-də həll olunduğu, istilik denaturasiyasından sonra asanlıqla yenidən qatlandığı və həmçinin daha aşağı qiymətlərdə α-spiralını saxladığı bildirilmişdir. pH 18. Bu uyğunsuzluqların ehtimal edilən izahı ondan ibarətdir ki, əvvəllər bildirilmiş təcrübələr otaq temperaturunda və ya aşağıda və ya nisbətən aşağı protein konsentrasiyalarında aparılmışdır16,18,19.
37°C-də inkubasiyadan sonra pH 8, 7, 6 və 154 mM NaCl (pH 8)-də NT flakonunun inversiya testi (100 mq/mL).b müvafiq olaraq 154 mM NaF və 154 mM NaCl olan və olmayan NT CD spektrləri.222 nm-də molar elliptiklik təbii qıvrımların nisbətinə çevrilir.c NT inversiya analizi (100 mg/mL) NT* (37 °C və 60 °C), NTA72R (37 °C) və His-NT-L6 (37 °C və 60 °C).d NT mutantlarının NT*, NTA72R və His-NT-L6 CD spektrləri.222 nm-də molar elliptiklik təbii qıvrımların nisbətinə çevrilir.e NTFlSp, NTMiSp və azaldılmış NTMiSp (100 mg/mL) inversiya testi.Ölçək çubuğu 5 mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp və azaldılmış NTMiSp-nin CD spektrləri.222 nm-də molar elliptiklik təbii qıvrımların nisbətinə çevrilir.25 °C və 95 °C-də tam NT spektrləri Əlavə Şəkil 8-də göstərilmişdir.
Fizioloji duz konsentrasiyası NT alt bölmələri arasında elektrostatik qarşılıqlı əlaqəni və NT-nin daha aşağı pH18-ə ötürülməsinin dimerizasiyasını müəyyən edir.154 mM NaCl və NaF-nin mövcudluğunun həqiqətən də müvafiq olaraq jelləşməni maneə törətdiyini aşkar etdik (Şəkil 5a, b; Əlavə Şəkil 2b) və bu duzların NT monomerlərinin istilik sabitliyini artırdığını (Şəkil 5b, Əlavə Şəkil 8) .Bu, həmçinin dimerləşmədən daha çox sabitliyin artırılmasının gel əmələ gəlməsinin qarşısını aldığını göstərir.
Zülalın dimerləşməsinin və jelləşmədə sabitliyin rolunu daha da araşdırmaq üçün biz iki mutantdan, NT* və NTA72R-dən istifadə etdik, onlar da aşağı pH28.30-da monomer olaraq qalır.NT*, monomerin görünən dipolyar yük paylanmasının yastılaşdığı, dimerləşmənin qarşısını alan və monomerin dayanıqlığını kəskin şəkildə artıran ikiqat yüklü əks mutantdır.NTA72R yüklü dipoldur, lakin Arg ilə əvəzlənmiş Ala dimer sərhədində yerləşir, ona görə də mutasiyalar dimerləşmə üçün tələb olunan subunit qarşılıqlı təsirlərinə müdaxilə edir.37°C-də inkubasiya edildikdən sonra NT* hidrogel əmələ gətirmədi, NTA72R isə 15 dəqiqə ərzində qeyri-şəffaf gel əmələ gətirdi (şək. 5c).Həm NT*, həm də NTA72R dimerləşə bilmədiyindən, lakin monomer sabitliyində fərqləndiyindən (Şəkil 5d), bu nəticələr yüksək termodinamik sabitliyin NT-nin jelləşməsinin qarşısını aldığını qəti şəkildə göstərir.Bunu HT* yüksək temperaturda qeyri-sabit olduqda (60°C-də 8 dəqiqədən sonra; şək. 5c) gel əmələ gətirməsi də bunu təsdiq edir.Əvvəllər göstərilmişdir ki, NT-də metioninin yüksək tərkibi onun təbii qatlanmasını mayeləşdirir və altı Met-Leu əvəzedicisi (burada His-NT-L6 kimi istinad edilir) NT46 monomerini güclü şəkildə sabitləşdirir.NT gel əmələ gəlməsi üçün struktur elastikliyin tələb olunduğu fərziyyəsinə əsaslanaraq, His-NT-L6 stabil mutantının 37 °C-də gelləşmədiyini aşkar etdik (Şəkil 5c, d).Bununla belə, His-NT-L6 60°С-də 60 dəqiqə ərzində inkubasiya edildikdə də gel əmələ gətirir (şək. 5c).
NT-nin β təbəqə strukturlarına çevrilməsi və hidrojellər əmələ gətirmə qabiliyyəti spidroinin bütün NT sahələrinə deyil, bəzilərinə şamil edilir.Müxtəlif ipək növlərindən və hörümçək növlərindən olan NT-lər, Trichonephila clavipes (NTFlSp) nisbətən aşağı metionin tərkibinə və yüksək istilik sabitliyinə baxmayaraq gellər əmələ gətirirdi (Şəkil 5e, f və Əlavə Cədvəl 2).Bunun əksinə olaraq, Araneus ventricosusdan (NTMiSp) kiçik ampulyar protein spidroindən olan NT aşağı istilik sabitliyi və yüksək metionin tərkibi ilə hidrogellər əmələ gətirməmişdir (Əlavə Cədvəl 2 və Şəkil 5e, f).Sonuncu molekuldaxili disulfid bağlarının olması ilə əlaqələndirilə bilər29,47.Ardıcıl olaraq, NTMiSp-nin disulfid bağları azaldıqda, 37 ° C-də 10 dəqiqə inkubasiya edildikdən sonra hidrogel əmələ gətirdi (Şəkil 5e).Sonda qeyd etmək lazımdır ki, struktur elastiklik NT-dən bir gel əmələ gəlməsi üçün vacib, lakin yeganə meyar deyil.Müvafiq ola biləcək başqa bir amil amiloid fibrillərinin əmələ gəlmə meylidir və fermuar verilənlər bazası və Vals alqoritmi ilə aparılan təhlillər gel əmələ gətirmə qabiliyyəti ilə amiloidogen bölgələrin mövcudluğu, həmçinin proqnozlaşdırılan bölgələrin miqyası arasında korrelyasiya göstərdi. sterik fermuarlar yaratmaq.Əlaqə var idi (Əlavə Cədvəl 2 və Əlavə Şəkil 9).
NT-nin əlverişli şəraitdə fibrillər əmələ gətirmək və gel əmələ gətirmək qabiliyyəti bizi digər zülal fraqmentləri ilə NT birləşmələrinin hələ də füzyon partnyorlarının tam funksiyasına malik gellər əmələ gətirə biləcəyini fərz etməyə vadar etdi.Bunu yoxlamaq üçün NT-nin C-terminusunda müvafiq olaraq yaşıl flüoresan zülal (GFP) və purin nukleosid fosforilazanı (PNP) təqdim etdik.Əldə edilən birləşmə zülalları E. coli-də çox yüksək yekun məhsuldarlıqla ifadə edildi (His-NT-GFP və His-NT-PNP üçün müvafiq olaraq 150 mq/L və 256 mq/L silkələnmə kolbası kulturaları), göstərilənlərə uyğundur. NT ilə birləşdirilən digər zülallar üçün Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) və His-NT-PNP (100mg/mL) füzyon zülalları 37°C-də 2 saat və 6,5 saatdan sonra gel əmələ gətirdi və ən əsası, GFP fraksiyası dəyişməz qaldı.jelləşmədən sonra müşahidə olunur, jelləşmədən sonra ilkin flüoresan intensivliyinin >70%-i qalır (Şəkil 6a).His-NT-PNP məhlullarında və gellərində PNP aktivliyini ölçmək üçün biz füzyon zülalını NT ilə seyreltməli olduq, çünki təmiz preparatın fermentativ fəaliyyəti gelləşmə konsentrasiyalarında analizin aşkarlama diapazonundan kənarda idi.Tərkibində 0,01 mq/mL His-NT-PNP və 100 mq/mL NT olan qarışıqdan əmələ gələn gel əvvəlcədən inkubasiya edilmiş nümunələrin ilkin fermentativ aktivliyinin 65%-ni saxlamışdır (Şəkil 6b).Ölçmə zamanı gel toxunulmaz qaldı (Əlavə Şəkil 10).
a His-NT-GFP (300 mq/mL) və tərkibində His-NT-GFP hidrogeli (300 mq/mL) olan ters çevrilmiş flakonun görünən və UV işığı altında jelləşməsindən əvvəl və sonra nisbi flüoresan intensivliyi.Nöqtələr fərdi ölçmələri göstərir (n = 3), səhv çubuqları standart sapmanı göstərir.Orta dəyər xəta çubuqlarının mərkəzində göstərilir.b PNP aktivliyi NT (100 mq/ml) və 0,01 mq/ml his-NT-PNP və 100 mq/ml Yeni Tayvan dollarından ibarət qarışıqdan ibarət məhlullardan və gellərdən istifadə etməklə flüorometrik analizlə əldə edilmişdir.İçəridə His-NT-PNP (5 mm miqyaslı çubuq) olan hidrojel olan ters çevrilmiş flakon göstərilir.
Burada 37°C-də zülal məhlulunu inkubasiya etməklə NT və digər rekombinant spidroin zülallarından hidrogellərin əmələ gəlməsini bildiririk (Şəkil 1).Biz göstəririk ki, gelləşmə α-spiralların β-qatlarına çevrilməsi və amiloidabənzər fibrillərin əmələ gəlməsi ilə bağlıdır (şək. 3 və 4).Bu tapıntı təəccüblüdür, çünki NT-lər bir neçə gün ərzində 4°C-də >200 mq/ml konsentrasiyalarda son dərəcə yüksək həllolma qabiliyyəti və yüksək stabilliyi ilə tanınan qıvrılmış qlobulyar beş sarmal dəstələridir27.Bundan əlavə, NT-lər µM-də aşağı protein konsentrasiyalarında istilik denatürasiyasından sonra asanlıqla yenidən qatlanır.Nəticələrimizə görə, fibril formalaşması >10 mq/ml protein konsentrasiyası və bir qədər yüksəlmiş temperaturun birləşməsini tələb edir (Şəkil 1).Bu, amiloid fibrillərinin fizioloji şəraitdə istilik dalğalanmalarına görə qismən açılmamış vəziyyətdə olan qlobulyar şəkildə bükülmüş zülallardan əmələ gələ biləcəyi fikri ilə uyğun gəlir 48 .Bu çevrilməyə məruz qalan zülallara misal olaraq insulin49,50, β2-mikroqlobulin, transtiretin və lizozim51,52,53 daxildir.NT öz doğma vəziyyətində α-spiral olsa da, polipeptid zəncirinin təxminən 65%-i sterik fermuar əmələ gəlməsinə uyğundur (Şəkil 4e) 45 .Monomer dinamik olaraq mobil olduğundan46, o, bu potensial amiloidogen bölgələri orta dərəcədə yüksək temperaturda ifşa edə bilər və ümumi zülalın yüksək konsentrasiyalarında amiloid fibril əmələ gəlməsi üçün kritik konsentrasiyaya çata bilər54.Bu mülahizədən sonra biz spidroinin konsentrasiyası ilə gelləşmə vaxtı arasında mənfi korrelyasiya tapdıq (Şəkil 1c) və əgər monomerik NT konformasiyası ya mutasiyalar (NT*, His-NT-L6) və ya duz əlavə etməklə sabitləşərsə, onda formalaşması hidrogelləri (şək. 5).
Əksər hallarda amiloid fibrilləri məhluldan çöküntü şəklində yox olur, lakin müəyyən şəraitdə hidrogellər əmələ gətirə bilirlər55,56,57.Hidrogel əmələ gətirən fibrillər adətən yüksək aspekt nisbətinə malikdir və molekulyar dolaşıq vasitəsilə sabit üçölçülü şəbəkələr əmələ gətirir,55,58 bizim nəticələrimizə uyğundur.In vitro hidrogel əmələ gəlməsi üçün zülallar çox vaxt tam və ya qismən açılır, məsələn, üzvi həlledicilərə, yüksək temperatura (70–90°C) və/və ya aşağı pH (1,5–3,0) 59,60,61,62.Burada təsvir edilən spidroin hidrogelləri sərt emal tələb etmir və hidrogelləri sabitləşdirmək üçün çarpaz birləşdirici maddələr tələb etmir.
Daha əvvəl bildirilmişdi ki, ipək əyirmə zamanı β-vərəq keçidinə məruz qalan spidroin təkrarları və QD-lər hidrogellər əmələ gətirir.Tapıntılarımızla müqayisədə inkubasiya müddətləri və/və ya inkubasiya temperaturları müvafiq olaraq əhəmiyyətli dərəcədə uzun və ya daha yüksək idi və nəticədə yaranan hidrogellər çox vaxt qeyri-şəffaf idi (Şəkil 7 və Əlavə Cədvəl 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Sürətli gel müddətinə əlavə olaraq, NT hidrogelləri >300 mq/mL (30%) bütün digər təsvir edilmiş rekombinant hörümçək ipək zülalı hidrogelləri, həmçinin jelatin, alginat (2%), agar (0,5%) kimi təbii hidrogelləri üstələyib. ) və kollagen.(0,6%) (Şəkil 7 və Əlavə Cədvəl 1 və 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Bu tədqiqatda hidrogellərin gel vaxtı və elastik modulu digər spidroin əsaslı hidrogellər və seçilmiş təbii hidrogellərlə müqayisə edilmişdir.İstinadlar gelasiya şərtlərinin təsviri ilə birlikdə verilir.APS Ammonium persulfat, otaq temperaturu.Məlumat 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Görünür, hörümçəklər spidroinin saxlanma zamanı jelləşməsinin qarşısını almaq yollarını inkişaf etdiriblər.İpək vəzində zülalın yüksək konsentrasiyasına baxmayaraq, terminal sahə ilə əlaqəli böyük təkrar bölgə, bu tədqiqatın sərhəddində vəzidə NT və CT-nin görünən konsentrasiyasının təxminən 10-20 mq / ml-ə uyğun olduğunu bildirir.in vitro müşahidə olunan hidrogel əmələ gəlməsi üçün tələb olunur.Bundan əlavə, duzların oxşar konsentrasiyaları 16 ipək vəzilərində olduğu kimi NT sabitləşdi (Şəkil 5b).NT konformasiyası E. coli sitozolunda tədqiq edilmişdir və in vitroda araşdırıldığından daha sıx qatlanmış olduğu aşkar edilmişdir ki, bu da duz və ya digər amillərin onun in vivo birləşməsinə mane olduğunu göstərir.Bununla belə, NT-lərin β-yaşaq fibrillərinə çevrilmə qabiliyyəti filament əmələ gəlməsi üçün vacib ola bilər və gələcək tədqiqatlarda araşdırılmalıdır.
Bu işdə müşahidə edilən NT-amiloid kimi fibril və hidrogel formalaşmasının yeni aspektlərinə əlavə olaraq, biz bu fenomenin biotexnoloji və biotibbi tətbiqlərə malik ola biləcəyini də göstəririk (Şəkil 8).Konsepsiyanın sübutu olaraq, biz NT-ni GFP və ya PNP ilə birləşdirdik və 37 °C-də inkubasiya edildikdə füzyon zülalının da hidrojellər əmələ gətirdiyini və GFP və PNP fraksiyalarının jelləşmədən sonra öz fəaliyyətini böyük ölçüdə saxladığını göstərdik (Şəkil 6).Nukleozid fosforilazlar nukleozid analoqlarının75 sintezinin mühüm katalizatorlarıdır ki, bu da bizim kəşfimizi biofarmasevtika sənayesi üçün aktual edir.Əlverişli şəraitdə şəffaf hidrogellər əmələ gətirən füzyon zülallarının ifadə konsepsiyası fermentlərin immobilizasiyası, idarə olunan dərmanların buraxılması və toxuma mühəndisliyi kimi geniş spektrli tətbiqlər üçün əlverişli xüsusiyyətlərə malik funksionallaşdırılmış hidrogellərin yaradılmasına imkan verir.Bundan əlavə, NT və NT* effektiv ifadə markerləridir30, bu o deməkdir ki, NT və onun variantları həll olunan birləşmə zülallarının yüksək məhsuldarlıqlı istehsalı və sonradan 3D hidrogellərdə hərəkətsizləşdirilmiş hədəf zülalların yaradılması üçün istifadə edilə bilər.
NT aşağı konsentrasiyalarda (µM) və 37°C-də həll olunan, α-spiralvari və sabitdir.Eyni temperaturda, lakin artan konsentrasiyalarda (>10 mq/ml) NT amiloidabənzər fibrillərdən ibarət gellər əmələ gətirir.NT füzyon zülalları həmçinin tam funksional füzyon fraqmentləri olan fibrilyar gellər əmələ gətirir və müxtəlif zülalların NT-dən istifadə edərək 3D hidrogellərdə immobilizasiyasına imkan verir.Aşağıda: NT (PDB: 4FBS) və lif şəbəkələrinin və əlaqəli zülal strukturlarının təsvirləri (ölçülü deyil, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4R).
Konstruksiyalar (amin turşusu ardıcıllıqları daxil olmaqla tam siyahı üçün Əlavə Cədvəl 4-ə baxın) pT7 plazmidinə klonlaşdırıldı və E. coli BL21-ə (DE3) çevrildi.Tərkibində mühəndis plazmidləri olan E. coli kanamisinlə (70 mq/l) əlavə edilmiş Luria bulyonunda aşılanmış və gecə ərzində 30°C və 250 rpm-də yetişdirilmişdir.Daha sonra kultura kanamisin olan LB mühitinə 1/100 paylandı və OD600 0,8-ə çatana qədər 30°C və 110 rpm-də becərildi.NMR tədqiqatları üçün bakteriyalar izotoplarla zülal etiketlənməsi üçün 2 q D-qlükoza 13C (Aldrich) və 1 q ammonium xlorid 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) olan M9 minimal mühitində yetişdirildi.Temperaturu 20 dərəcə Selsiyə endirin və 0,15 mM izopropiltioqalaktopiranosid (son konsentrasiya) ilə protein ifadəsini induksiya edin.Gecədə protein ifadə edildikdən sonra hüceyrələr 7278 × g, 4 ° C-də 20 dəqiqə yığıldı.Hüceyrə qranulları 20 mM Tris-HCl, pH 8-də yenidən dayandırıldı və sonrakı istifadəyə qədər donduruldu.Ərimiş hüceyrələr 30 kPa-da hüceyrə pozucusu (TS seriyalı maşınlar, Constant Systems Limited, İngiltərə) istifadə edərək parçalandı.Sonra lizatlar 4°C-də 30 dəqiqə 25000 q-da sentrifuqa edilmişdir.NTMiSp üçün qranul sonra 2 M karbamid, 20 mM Tris-HCl, pH 8-də yenidən dayandırıldı və 2 dəqiqə (2 saniyə yandırma/söndürmə, 65%) sonikasiya edildi, sonra yenidən 25,000 xg, 4°C-də sentrifuqa edildi. 30 dəq.Supernatant Ni-NTA sütununa yükləndi, 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8 ilə yuyuldu və nəhayət, zülal 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8 ilə yuyuldu. NT2Rep yaratmaq və yaratmaq üçün NTCT, trombin həzmi His və NT arasında yer (ThrCleav) təqdim edir.Trombinin parçalanma yerləri His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep istehsal edir), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT istehsal edir), His-thoredoxin-ThrCleav-CT (CT istehsal edir), His-Tioredoxin-ThrCleav-NT-də də mövcuddur. .* (NT* istehsal edir), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R istehsal edir), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp istehsal edir) və His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (NTMSp istehsal edir).Konstruksiyalar trombinlə (1:1000) həzm olundu və 6-8 kDa molekulyar çəki həddi olan Spectra/Por dializ membranından istifadə edərək, 20 mM Tris-HCl, pH 8 ilə 4° C-də gecə ərzində dializ edildi.Dializdən sonra məhlul Ni-NTA sütununa yüklənir və tərkibində maraq doğuran zülal olan tullantı suyu toplanır.Protein konsentrasiyaları istehsalçının protokoluna uyğun olaraq Bradford analizindən istifadə edən NTF1Sp istisna olmaqla, hər bir zülalın sönmə əmsalı ilə 280 nm-də UV absorbsiyasını ölçməklə müəyyən edilmişdir.Saflıq SDS poliakrilamid (4-20%) gel elektroforezi və Coomassie parlaq mavi rəngləmə ilə müəyyən edilmişdir.Zülallar sentrifuqa filtrlərindən (VivaSpin 20, GE Healthcare) istifadə edərək 4000 xg-da 20 dəqiqəlik dövrlərdə 10 kDa molekulyar çəki kəsimi ilə konsentrasiya edilmişdir.
Protein məhlulunu əridin və diqqətlə 150 ​​µl-ni 1 ml şəffaf septum flakonuna (8 x 40 mm Thermo Scientific) pipetləyin.Boruların qapağı bağlandı və buxarlanmanın qarşısını almaq üçün parafilm ilə bağlandı.Nümunələr (n = 3) 37°C və ya 60°C-də inkubasiya edilmiş və jelləşməni müşahidə etmək üçün vaxtaşırı tərsinə çevrilmişdir.Gel olmayan nümunələr ən azı bir həftə inkubasiya edildi.10 µM zülal üçün 10 mM DTT ilə NTMiSp disulfid bağlarını azaldın.Təbii hörümçək ipək örtüklərinin jelləşməsini təhlil etmək üçün İsveç körpüsü hörümçək kəsildi, iki əsas ampulasiya edilmiş vəzi 200 μl 20 mM Tris-HCl tampon pH 8-ə yerləşdirildi və örtünün bezlərdən ayrılmasına imkan vermək üçün kəsildi..Vəzilərin tərkibi buferdə həll edilir, quru kütlənin təyini üçün 50 µl (açıq flakonların 60 °C-də sabit çəkiyə inkubasiyası ilə) və 37 °C-də jelləşmə üçün 150 µl.
Ölçmə həndəsəsi/aləti üst diametri 20 mm və boşluq 0,5 mm olan paralel lövhədən istifadə edərək paslanmayan poladdan hazırlanır.Paslanmayan poladdan hazırlanmış Peltier plitəsindən istifadə edərək, nümunəni dəqiqədə 1 °C sürətlə 25 °C-dən 45 °C-ə qədər və yenidən 25 °C-yə qədər qızdırın.Vibrasiya ölçmələri 0,1 Hz tezliyində və materialın xətti viskoelastik bölgəsində 100 mq/mL və 300-500 mq/mL nümunələr üçün müvafiq olaraq 5% və 0,5% deformasiyada aparılmışdır.Buxarlanmanın qarşısını almaq üçün xüsusi bir rütubət kamerasından istifadə edin.Məlumat Prism 9-dan istifadə etməklə təhlil edilib.
800-dən 3900 sm-1-ə qədər otaq temperaturunda infraqırmızı (İQ) spektrləri toplamaq üçün.ATR cihazı, həmçinin spektrometrdən keçən işıq yolu təcrübədən əvvəl və sınaq zamanı quru süzülmüş hava ilə təmizlənir.Məhlullar (500 mq/mL spektrlərdə suyun udulma piklərini minimuma endirmək üçün) kristalların üzərinə pipetlə vuruldu və ölçmədən əvvəl gellər (500 mq/mL) əmələ gəldi və sonra kristallara köçürüldü (n = 3).1000 skan 2 sm-1 qətnamə və 2 sıfır iş dövrü ilə qeydə alınıb. İkinci törəmə doqquz ballıq hamarlama diapazonundan istifadə edərək OPUS (Bruker) istifadə edərək hesablanıb.Spektrlər F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software” proqramından istifadə etməklə 1720 və 1580 sm-1 arasında eyni inteqrasiya bölgəsinə normallaşdırıldı.ATR-IR spektroskopiyasında infraqırmızı şüanın nümunəyə nüfuz etmə dərinliyi dalğa sayından asılıdır, nəticədə daha yüksək dalğa nömrələrinə nisbətən aşağı dalğa nömrələrində daha güclü udma olur.Şəkildə göstərilən spektrlər üçün bu təsirlər düzəldilməyib.3, çünki onlar çox kiçikdir (Əlavə Şəkil 4).Bu rəqəm üçün düzəldilmiş spektrlər Bruker OPUS proqram təminatından istifadə etməklə hesablanmışdır.
Prinsipcə, amid I zirvəsi daxilində komponentlərin etibarlı dekonvolyutsiyasından sonra zülal konformasiyalarının hərtərəfli kəmiyyəti mümkündür.Lakin praktikada bəzi maneələr yaranır.Spektrdəki səs-küy dekonvolution zamanı (yanlış) zirvələr kimi görünə bilər.Bundan əlavə, suyun əyilməsi nəticəsində yaranan pik amid I zirvəsinin mövqeyi ilə üst-üstə düşür və burada tədqiq edilən sulu gel kimi çox miqdarda su olan nümunələr üçün oxşar miqyasda ola bilər.Buna görə də, biz amid I zirvəsini tamamilə parçalamağa cəhd etmədik və müşahidələrimiz yalnız NMR spektroskopiyası kimi digər üsulları dəstəkləmək üçün nəzərə alınmalıdır.
50 mq/ml NT və His-NT2RepCT məhlulları gecə ərzində 37°C-də jelləşdirildi.Sonra hidrogel 20 mM Tris-HCl (pH 8) ilə 12,5 mq/ml konsentrasiyaya qədər seyreltildi, yaxşıca çalxalandı və geli parçalamaq üçün pipetlə vuruldu.Sonra, hidrogel 20 mM Tris-HCl (pH 8) ilə 10 dəfə seyreltildi, 5 μl nümunə formavar ilə örtülmüş bir mis torna tətbiq edildi və artıq nümunə qurutma kağızı ilə çıxarıldı.Nümunələr iki dəfə 5 µl MilliQ su ilə yuyuldu və 5 dəqiqə ərzində 1% uranil format ilə boyandı.Artıq ləkəni emici kağızla çıxarın, sonra torunu hava ilə qurutun.Təsvir bu şəbəkələrdə 100 kV-da işləyən FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN istifadə edərək həyata keçirilib.Şəkillər Veleta 2k × 2k CCD kameradan (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Almaniya) istifadə edərək x 26,500 və x 43,000 böyütmələrdə qeydə alınıb.Hər nümunə üçün (n = 1) 10-15 şəkil qeydə alınıb.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) təsvirin təhlili və lif diametrlərinin ölçülməsi üçün istifadə edilmişdir (n = 100, müxtəlif liflər).Prizma 9 cütləşməmiş t-testlərini (iki quyruqlu) yerinə yetirmək üçün istifadə edilmişdir.Orta His-NT2RepCT və NT fibrilləri müvafiq olaraq 11.43 (SD 2.035) və 7.67 (SD 1.389) nm idi.Etibar intervalı (95%) -4,246 ilə -3,275 arasındadır.sərbəstlik dərəcələri = 198, p <0,0001.
Tərkibində 10 µM tioflavin T (ThT) olan 80 µl maye nümunələri üç nüsxədə (n = 3) statik şəraitdə Corning 96 quyulu qara dibi şəffaf dib lövhələrindən (Corning Glass 3881, ABŞ) istifadə edilərək ölçüldü.Floresans fərqləri 440 nm həyəcan filtrindən və 480 nm emissiya filtrindən (BMG Labtech, Offenburq, Almaniyadan FLUOStar Galaxy) istifadə edilərək qeydə alınıb.ThT siqnalı nə doymuş, nə də söndürülmüşdür, çünki ThT-nin müxtəlif konsentrasiyaları ilə təcrübələr siqnal intensivliyi dəyişdirilmədən aparılmışdır.Dumanın ölçülməsi üçün 360 nm-də udma qabiliyyətini qeyd edin.Toxum əkmə təcrübələri üçün 37°C-də 100 mq/mL gellər əmələ gətirildi, yenidən dayandırıldı və 5%, 10% və 20% molyar nisbətlərdə toxum əkmək üçün istifadə edildi.Məlumat Prism 9-dan istifadə etməklə təhlil edilib.
His-NT2RepCT və NT >100 mq/mL ehtiyatlarını buz üzərində əridin və 0,22 µm filtrdən süzün.Konsentrasiyalar Nanodrop istifadə edərək 280 nm-də absorbsiyanı ölçməklə hesablanmışdır.Şəffaf dibi olan 96 quyulu qara bağlayıcı olmayan boşqabın (Corning) quyularında nümunələr 20 mM Tris-HCl pH 8-də 20 mq/ml qədər seyreltilmiş və 5 μM ThT (son konsentrasiya), ümumi nümunə konsentrasiyası ilə qarışdırılmışdır. 50 μl həcm.Nümunələr, ThT təsviri üçün ötürülən işıq kanalı və FITC həyəcanlandırma və emissiya filtr dəstləri olan CellObserver (Zeiss) mikroskopunda 37 °C-də hər 10 dəqiqədən bir təsvir edilmişdir.Təsvir üçün 20x/0.4 lens istifadə olunur.Təsvirin təhlili üçün Zen Blue (Zeiss) və ImageJ (https://imagej.nih.gov/) istifadə edilmişdir.Gellər həmçinin NT və His-NT2RepCT məhlullarından 20 mM Tris pH 8 və 5 µM ThT olan 50 mq/mL konsentrasiyada hazırlanmış və 37°C-də 90 dəqiqə inkubasiya edilmişdir.Gel parçaları 20 mM Tris, pH 8 və 5 μM ThT olan yeni bir quyuya köçürüldü, qara rəngli 96 quyu şəffaf alt lövhədə.20x/0.4 böyütmədə yaşıl flüoresan və parlaq sahə şəkilləri əldə edin.ImageJ təsvirin təhlili üçün istifadə edilmişdir.
Həll NMR spektrləri QCI Quadrupole Rezonans İmpuls Gradient Sahə Kriyoprobu (HFCN) ilə təchiz edilmiş 600 MHz Bruker Avance Neo spektrometrində 310 K-də əldə edilmişdir.13C, 15N ilə etiketlənmiş, 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) həll edilmiş 10 mq/mL homojen protein ehtiva edən NMR nümunələri .NT2RepCT-nin pH 6.7-də kimyəvi yerdəyişmələri 15N-HSQC-nin 2D spektrində pik 23 təyin etmək üçün istifadə edilmişdir.
Sehrli bucaq fırlanan bərk NMR (MAS) spektrləri 13C, 15N etiketli hidrogellər 3,2 mm 13C/15N{1H} elektronsuz zond ilə təchiz olunmuş 800 MHz tezliyində Bruker Avance III HD spektrometrində qeydə alınıb.Nümunə temperaturu 277 K-də dəyişən temperaturlu qaz axınından istifadə etməklə idarə olundu. İkiölçülü dipol fırlanma rezonansı (DARR)76 və radiotezliyin yenidən qoşulması (RFDR)77 spektrləri müvafiq olaraq 12,5 kHz və 20 kHz MAS tezliklərində əldə edildi.1H-dən 13C-ə qədər çarpaz qütbləşmə (CP) 1H-də 60.0-dan 48.0 kHz-ə qədər, 13C-də 61.3/71.6 kHz (12.5/20 kHz MAS-da) və əlaqə müddəti 0.5-1 ms-dən istifadə edərək həyata keçirildi.Məlumatların toplanması zamanı 73,5 kHz-də Spinal6478 decoupling istifadə edilmişdir.Alma vaxtı 10 millisaniyə, dövrün gecikməsi isə 2,5 saniyə idi.RFDR spektrlərində müşahidə edilən tək bağlı Cα/Cβ korrelyasiyaları DARR spektrlərində xarakterik qalıq tipli kimyəvi sürüşmələrə və çoxalmaya bağlı korrelyasiyalara əsasən təyin edilmişdir.
Zipper79 verilənlər bazası (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp və NTMiSp üçün çırpınma meyllərini və Rosetta enerjisini qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir.Zipper verilənlər bazası zülal strukturunu modelləşdirmək və təhlil etmək üçün bir neçə pulsuz enerji funksiyasını birləşdirən Rosetta Energy80-ni hesablayır.Enerji səviyyəsi -23 kkal/mol və ya daha aşağı olması fibrilasiyaya yüksək meyli göstərir.Aşağı enerji fermuar konformasiyasında iki β-telin daha çox sabitliyi deməkdir.Bundan əlavə, Vals alqoritmi NT, NTFlSp və NTMiSp Ref-də amiloidogen bölgələri proqnozlaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT zülal məhlulu pH-nı müvafiq olaraq pH 6 və 7-yə endirmək üçün pH 5,5 və 6,0-da 2-(N-morfolino)etansulfon turşusu (MES) tamponu ilə qarışdırıldı.Son protein konsentrasiyası 100 mq/ml idi.
Ölçmələr J-1500 CD spektrometrində (JASCO, ABŞ) optik yolu 0,1 sm olan 300 μL kyuvetdən istifadə etməklə aparılmışdır.Zülallar 20 mM fosfat tamponunda (pH 8) 10 μM (n = 1) qədər seyreltildi.Duzun iştirakı ilə zülal sabitliyini təhlil etmək üçün zülallar müvafiq olaraq 154 mM NaF və ya NaCl olan 20 mM fosfat tamponunda (pH 8) eyni konsentrasiyada (n = 1) təhlil edildi.Temperatur skanları 222 nm-də 25 ° C-dən 95 ° C-ə qədər 1 ° C/dəq istilik dərəcəsi ilə qeydə alınıb.Doğma şəkildə qatlanmış zülalların nisbəti (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) düsturu ilə hesablanmışdır.Bundan əlavə, 25°C-də və 95°C-yə qədər qızdırıldıqdan sonra 260 nm-dən 190 nm-ə qədər hər nümunə üçün beş spektr qeydə alınıb.Beş spektrin ortalaması alındı, hamarlandı və molar elliptikliyə çevrildi.Məlumat Prism 9-dan istifadə etməklə təhlil edilib.
His-NT-GFP-nin (300 mq/mL, 80 µL) flüoresans intensivliyi statik şəraitdə qara şəffaf dibi olan 96 quyuluq Corning lövhələrində (Corning Glass 3881, ABŞ) üç nüsxədə (n = 3) ölçüldü.Nümunələri həyəcan dalğası uzunluğu 395 nm olan flüoresan əsaslı lövhə oxuyucusu ilə ölçün və emissiyanı jelləşmədən əvvəl 509 nm-də və 2 saat sonra 37°C-də qeyd edin.Məlumatlar Prism 9 ilə təhlil edilib.
İstehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq purin nukleozid fosforilaz aktivliyinin təhlili dəsti (fluorometrik üsul, Sigma Aldrich) istifadə edilmişdir.Tərkibində His-NT-PNP olan gel və məhlullarda aktivliyi ölçmək üçün 10 ng His-NT-PNP ilə 100 mq/mL NT ilə ümumi həcmi 2 µL olana qədər qarışdırın, çünki gel setin aşkarlama intervalından yuxarı siqnal verdi.His-NT-PNP olmayan gellər və məhlullar üçün nəzarətlər daxil edilmişdir.Ölçmələr iki dəfə aparıldı (n = 2).Fəaliyyət ölçüldükdən sonra reaksiya qarışığı çıxarıldı və ölçmə zamanı gelin toxunulmaz qalmasını təmin etmək üçün gelin şəkli çəkildi.Məlumat Prism 9-dan istifadə etməklə təhlil edilib.
Tədqiqatın dizaynı haqqında daha çox məlumat üçün bu məqalə ilə əlaqəli Təbiət tədqiqatının xülasəsinə baxın.
Şəkil 1 və 2 ilkin məlumatları təqdim edir.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f və 6, Əlavə Şek.3, əlavə şək.5a, d, əlavə şək.6 və əlavə şək.8. Bu tədqiqatdan əldə edilən məlumatlar https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 Zenodo verilənlər bazasında yerləşdirilib.Bu araşdırmada əldə edilən NMR məlumatları bmrbig36 giriş ID-si altında BMRBig deposuna yerləşdirildi.GFP və PNP strukturları PDB-dən götürülüb (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. və Johansson, J. Spinning süni hörümçək ipəyi.Milli Kimya.biologiya.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes genomu hörümçək ipək genlərinin müxtəlifliyini və onların kompleks ifadəsini vurğulayır.Milli Genette.49, 895–903 (2017).