304 Paslanmayan poladdan qaynaqlanmış qıvrımlı boru/boru zhemical zomponent, Qlobal dəniz mikrobiomunun biosintetik potensialı

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.
Hər slaydda üç məqalə göstərən slayderlər.Slaydlar arasında hərəkət etmək üçün geri və sonrakı düymələrdən və ya hər slaydda hərəkət etmək üçün sonundakı slayd nəzarətçi düymələrindən istifadə edin.

Ətraflı məhsul təsviri

304 Paslanmayan poladdan qaynaqlanmış qıvrımlı boru / boru
1. Spesifikasiya: Paslanmayan polad boru / boru
2. Növ: qaynaqlı və ya tikişsiz
3. Standart: ASTM A269, ASTM A249
4. Paslanmayan polad rulon boru OD: 6mm - 25.4MM
5. Uzunluq: 600-3500MM və ya müştərinin tələbinə uyğun olaraq.
6. Divar qalınlığı: 0,2 mm - 2,0 mm.

7. Tolerantlıq: OD: +/-0.01mm;Qalınlıq: +/-0,01%.

8. Bobin daxili deşik ölçüsü: 500MM-1500MM (müştəri tələblərinə uyğun olaraq tənzimlənə bilər)

9. Bobin hündürlüyü: 200MM-400MM (müştəri tələblərinə uyğun olaraq tənzimlənə bilər)

10. Səth: Parlaq və ya tavlanmış
11. Material: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, lehimli 625, 825, 2205, 2507 və s.
12. Qablaşdırma: taxta qutuda toxunmuş çantalar, taxta altlıqlar, taxta mil və ya müştərinin tələbinə uyğun olaraq
13. Test: kimyəvi komponent, məhsuldarlıq, dartılma gücü, sərtliyin ölçülməsi
14. Zəmanət: Üçüncü tərəf (məsələn: SGS TV) yoxlaması və s.
15. Tətbiq: Dekorasiya, mebel, neft daşınması, istilik dəyişdiricisi, məhəccər istehsalı, kağız istehsalı, avtomobil, qida emalı, tibbi və s.

Təbii mikrob icmaları filogenetik və metabolik cəhətdən müxtəlifdir.Az öyrənilmiş orqanizm qruplarına1 əlavə olaraq, bu müxtəliflik həm də ekoloji və biotexnoloji əhəmiyyətli fermentlərin və biokimyəvi birləşmələrin kəşfi üçün zəngin potensiala malikdir2,3.Bununla belə, bu cür birləşmələri sintez edən və onları müvafiq sahiblərinə bağlayan genomik yolları müəyyən etmək üçün bu müxtəlifliyi öyrənmək hələ də problem olaraq qalır.Açıq okeanda mikroorqanizmlərin biosintetik potensialı qlobal miqyasda bütöv genom həlli məlumatlarının təhlilindəki məhdudiyyətlər səbəbindən böyük ölçüdə naməlum olaraq qalır.Burada, 1000-dən çox dəniz suyu nümunəsindən 25.000-dən çox yeni rekonstruksiya edilmiş qaralama genomları ilə mədəni hüceyrələrdən və tək hüceyrələrdən təxminən 10.000 mikrob genomunu birləşdirərək okeandakı biosintetik gen qruplarının müxtəlifliyini və müxtəlifliyini araşdırırıq.Bu səylər 40.000-ə yaxın ehtimal olunan əsasən yeni biosintetik gen qruplarını müəyyən etdi, bəziləri əvvəllər şübhəli bilinməyən filogenetik qruplarda tapıldı.Bu populyasiyalarda biz becərilməmiş bakteriya filumuna aid olan və bu mühitdə ən biosintetik cəhətdən müxtəlif mikroorqanizmlərdən bəzilərini özündə birləşdirən biosintetik gen qruplarında (“Candidatus Eudormicrobiaceae”) zənginləşdirilmiş nəsil müəyyən etdik.Bunlardan biz fosfataza-peptid və pitonamid yollarını xarakterizə etdik, müvafiq olaraq qeyri-adi bioaktiv birləşmə strukturunun və enzimologiyanın nümunələrini müəyyən etdik.Nəticə olaraq, bu tədqiqat mikrobioma əsaslı strategiyaların yaxşı başa düşülməyən mikrobiota və mühitdə əvvəllər təsvir olunmamış fermentlərin və təbii qidaların tədqiqinə necə imkan verə biləcəyini nümayiş etdirir.
Mikroblar qlobal biogeokimyəvi dövrləri idarə edir, qida şəbəkələrini qoruyur, bitki və heyvanları sağlam saxlayır5.Onların nəhəng filogenetik, metabolik və funksional müxtəlifliyi yeni taksonların1, fermentlərin və biokimyəvi birləşmələrin, o cümlədən təbii məhsulların kəşfi üçün zəngin potensialı təmsil edir6.Ekoloji icmalarda bu molekullar mikroorqanizmlərə ünsiyyətdən tutmuş rəqabətə qədər müxtəlif fizioloji və ekoloji funksiyaları təmin edir 2, 7 .Orijinal funksiyalarına əlavə olaraq, bu təbii məhsullar və onların genetik kodlu istehsal yolları biotexnoloji və terapevtik tətbiqlər üçün nümunələr təqdim edir2,3.Bu cür yolların və əlaqələrin müəyyən edilməsi mədəni mikrobların tədqiqi ilə çox asanlaşdırılıb.Lakin təbii mühitlərin taksonomik tədqiqatları göstərmişdir ki, mikroorqanizmlərin böyük əksəriyyəti becərilməmişdir8.Bu mədəni qərəz bir çox mikroblar tərəfindən kodlaşdırılmış funksional müxtəliflikdən istifadə etmək qabiliyyətimizi məhdudlaşdırır4,9.
Bu məhdudiyyətləri aradan qaldırmaq üçün son onillikdə texnoloji irəliləyişlər tədqiqatçılara birbaşa (yəni, əvvəlcədən mədəniyyət olmadan) bütün icmalardan (metagenomics) və ya tək hüceyrələrdən mikrob DNT fraqmentlərini ardıcıllıqla sıralamağa imkan verdi.Bu fraqmentləri daha böyük genom fraqmentlərinə yığmaq və müvafiq olaraq çoxlu metagenomik şəkildə yığılmış genomları (MAGs) və ya tək gücləndirilmiş genomları (SAG) yenidən qurmaq bacarığı mikrobiomun (yəni, mikrob icmaları və mikrobiomun) taksosentrik tədqiqatları üçün mühüm fürsət açır.yeni yollar açır.müəyyən mühitdə öz genetik materialı) 10,11,12.Həqiqətən də, son tədqiqatlar Yer kürəsində mikrob müxtəlifliyinin filogenetik təmsilçiliyini xeyli genişləndirmişdir1, 13 və əvvəllər mədəni mikroorqanizm istinad genom ardıcıllığı (REFs) ilə əhatə olunmayan fərdi mikrob icmalarında funksional müxtəlifliyin çoxunu aşkar etmişdir14.Kəşf edilməmiş funksional müxtəlifliyi ev sahibi genomun kontekstində yerləşdirmək bacarığı (yəni, genomun həlli) yeni təbii məhsulları kodlaşdıran hələ xarakterik olmayan mikrob xətlərini proqnozlaşdırmaq üçün vacibdir15,16 və ya bu cür birləşmələri orijinal istehsalçıya qaytarmaq üçün17.Məsələn, birləşmiş metagenomik və birhüceyrəli genomik analiz yanaşması metabolik cəhətdən zəngin süngərlə əlaqəli bakteriyalar qrupu Candidatus Entotheonella-nın müxtəlif dərman potensiallarının istehsalçıları kimi müəyyən edilməsinə səbəb olmuşdur18.Bununla belə, müxtəlif mikrob icmalarının genomik tədqiqi cəhdlərinə baxmayaraq,16,19 Yerin ən böyük ekosistem okeanı16,20 üçün qlobal metagenomik məlumatların üçdə ikisindən çoxu hələ də itkindir.Beləliklə, ümumiyyətlə, dəniz mikrobiomunun biosintetik potensialı və onun yeni fermentativ və təbii məhsulların anbarı kimi potensialı böyük ölçüdə öyrənilməmişdir.
Qlobal miqyasda dəniz mikrobiomlarının biosintetik potensialını araşdırmaq üçün ilk növbədə filogenetika və gen funksiyası haqqında geniş məlumat bazası yaratmaq üçün mədəniyyətdən asılı və qeyri-mədəniyyət üsullarından istifadə etməklə əldə edilmiş dəniz mikrob genomlarını birləşdirdik.Bu verilənlər bazasının tədqiqi nəticəsində çoxlu sayda biosintetik gen klasterləri (BGC) aşkar edilmişdir ki, onların əksəriyyəti hələ də xarakterik olmayan gen klasteri (GCF) ailələrinə aiddir.Bundan əlavə, biz açıq okeanda bu günə qədər məlum olan ən yüksək BGC müxtəlifliyini nümayiş etdirən naməlum bakteriya ailəsini müəyyən etdik.Hazırda məlum olan yollardan genetik fərqlərinə əsaslanaraq eksperimental yoxlama üçün iki ribosomal sintez və post-translationally dəyişdirilmiş peptid (RiPP) yolunu seçdik.Bu yolların funksional xarakteristikası gözlənilməz enzimologiya nümunələrini, eləcə də proteaz inhibitor fəaliyyəti olan struktur qeyri-adi birləşmələri aşkar etmişdir.
Əvvəlcə biz genom analizi üçün onun bakterial və arxeal komponentlərinə diqqət yetirməklə qlobal məlumat resursu yaratmağı hədəflədik.Bu məqsədlə biz metagenomik məlumatları və qlobal miqyasda yayılmış 215 nümunə götürmə yerindən (en diapazonu = 141,6°) və bir neçə dərin təbəqədən (pelagik, mezopelagik və abyssal zonaları əhatə edən dərinlikdə 1-dən 5600 m-ə qədər) 1038 dəniz suyu nümunəsini birləşdirdik.Ümumi məlumat21,22,23 (Şəkil 1a, genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 1a və Əlavə Cədvəl 1).Geniş coğrafi əhatəni təmin etməklə yanaşı, bu seçmə süzülmüş nümunələr bizə dəniz mikrobiomunun müxtəlif komponentlərini, o cümlədən virusla zəngin (<0,2 µm), prokaryotiklərlə zəngin (0,2–3 µm), hissəciklərlə zəngin (0,8 µm) da daxil olmaqla, müqayisə etməyə imkan verdi. ).–20 µm) və virusla tükənmiş (>0,2 µm) koloniyalar.
a, 215 qlobal paylanmış yerdən (62°C-dən 79°Ş. və 179°Ş-dən 179°Ş-a qədər) toplanmış dəniz mikrob icmalarının cəmi 1038 ictimaiyyətə açıq genomu (metagenomics).Xəritə plitələr © Esri.Mənbələr: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ və Esri.b, bu metagenomlar məlumat dəstlərində (rənglə işarələnmiş) kəmiyyət və keyfiyyət (metodlar) baxımından fərqlənən MAG-lərin (metodlar və əlavə məlumat) yenidən qurulması üçün istifadə edilmişdir.Yenidən qurulmuş MAG-lər əl istehsalı MAG26, SAG27 və REF daxil olmaqla, ictimaiyyətə açıq (xarici) genomlarla tamamlandı.27 OMD tərtib edin.c, yalnız SAG (GORG)20 və ya MAG (GEM)16-ya əsaslanan əvvəlki hesabatlarla müqayisədə, OMD dəniz mikrob icmalarının genomik səciyyələndirilməsini (metagenomik oxunma sürəti; metod) dərinliyi və daha ardıcıl təmsili ilə iki-üç dəfə yaxşılaşdırır. enlik..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n = 132, 30-60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, FHN, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD növ qrupları səviyyəsinə qruplaşdırılması (95% orta nukleotid eyniliyi) cəmi müəyyən edir təxminən 8300 növ, onların yarısından çoxu əvvəllər GTDB (versiya 89) istifadə edərək taksonomik şərhlərə görə xarakterizə edilməmişdir e, növlərin genom tipinə görə təsnifatı göstərdi ki, MAG, SAG və REF-lərin filogenetik müxtəlifliyini əks etdirmək üçün bir-birini yaxşı tamamlayır. dəniz mikrobiomu.Xüsusilə növlərin 55%-i, 26%-i və 11%-i MAG, SAG və REF üçün spesifik olmuşdur.BATS, Bermuda Atlantik Zaman Seriyası;GEM, Yer mikrobiomunun genomları;GORG, qlobal okean istinad genomu;HOT, Havay okeanı zaman seriyası.
Bu məlumat dəstindən istifadə edərək, əsasən bakterial və arxaeal olmaqla cəmi 26,293 MAG-ni yenidən qurduq (Şəkil 1b və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 1b).Biz bu MAG-ləri müxtəlif yerlərdən və ya vaxt nöqtələrindən (metodlardan) olan nümunələr arasında təbii ardıcıllıq dəyişkənliyinin dağılmasının qarşısını almaq üçün birləşdirilmiş metagenomik nümunələrdən deyil, ayrı-ayrılıqda yığılmış birləşmələrdən yaratdıq.Bundan əlavə, biz genomik fraqmentləri onların çoxlu sayda nümunələr arasında yayılma korrelyasiyası əsasında qruplaşdırdıq (sorğudan asılı olaraq 58-dən 610-a qədər nümunə; metod).Biz müəyyən etdik ki, bu, çox vaxt aparan, lakin vacib addım24, bir neçə irimiqyaslı MAG16, 19, 25 yenidənqurma işlərində atlanmış və kəmiyyəti (orta hesabla 2,7 dəfə) və keyfiyyətini (orta hesabla +20%) əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırmışdır. genom.burada tədqiq edilən dəniz metagenomundan yenidən qurulmuşdur (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 2a və əlavə məlumat).Ümumilikdə, bu səylər bu gün mövcud olan ən əhatəli MAG resursu ilə müqayisədə dəniz mikroblarının MAG-lərinin 4,5 dəfə artması ilə nəticələndi (yalnız yüksək keyfiyyətli MAG-lər nəzərə alınarsa, 6 dəfə) (Metodlar).Bu yeni yaradılmış MAG dəsti daha sonra 830 əl ilə seçilmiş MAG26, 5969 SAG27 və 1707 REF ilə birləşdirildi.İyirmi yeddi növ dəniz bakteriyası və arxeya 34,799 genomdan ibarət kombinator kolleksiyasını təşkil etmişdir (Şəkil 1b).
Daha sonra dəniz mikrob icmalarını təmsil etmək və müxtəlif genom növlərinin inteqrasiyasının təsirini qiymətləndirmək qabiliyyətini artırmaq üçün yeni yaradılmış resursu qiymətləndirdik.Orta hesabla biz tapdıq ki, o, dəniz metagenomik məlumatlarının təxminən 40-60%-ni əhatə edir (Şəkil 1c), həm dərinlikdə, həm də genişlikdə əvvəlki MAG hesabatlarından iki-üç dəfə daha çox seriya 16 və ya SAG20 əhatə edir.Bundan əlavə, müəyyən edilmiş kolleksiyalarda taksonomik müxtəlifliyi sistematik şəkildə ölçmək üçün biz Genom Taksonomiyası Verilənlər Bazasının (GTDB) alətlər dəstindən (metodlardan) istifadə edərək bütün genomları şərh etdik və 95% orta genom miqyasında nukleotid eyniliyindən istifadə etdik.28 8.304 növ klasterini (növünü) müəyyən etmək.Bu növlərin üçdə ikisi (yeni təbəqələr daxil olmaqla) əvvəllər GTDB-də görünməmişdi, onlardan 2790-ı bu tədqiqatda yenidən qurulmuş MAG-dən istifadə etməklə aşkar edilmişdir (Şəkil 1d).Bundan əlavə, müxtəlif növ genomların yüksək dərəcədə tamamlayıcı olduğunu aşkar etdik: növlərin 55%, 26% və 11% -i tamamilə MAG, SAG və REF-dən ibarətdir (Şəkil 1e).Bundan əlavə, MAG su sütununda tapılan 49 növün hamısını əhatə edirdi, SAG və REF isə müvafiq olaraq onlardan yalnız 18 və 11-ni təmsil edirdi.Bununla belə, SAG demək olar ki, 1300 növü və MAG yalnız 390 növü əhatə edən Pelagic Bacteriales (SAR11) kimi ən ümumi təbəqələrin müxtəlifliyini (genişlənmiş məlumat, Şəkil 3a) daha yaxşı təmsil edir.Qeyd edək ki, REF-lər nadir hallarda növlər səviyyəsində MAG və ya SAG-larla üst-üstə düşür və burada tədqiq edilən açıq okean metagenomik dəstlərində tapılmayan təxminən 1000 genomun >95%-ni təmsil edirdi, əsasən də digər növ təcrid olunmuş təmsil dəniz nümunələri (məsələn, çöküntülər) ilə qarşılıqlı əlaqəyə görə. .və ya host-əlaqədar).Onu elmi ictimaiyyətə geniş şəkildə təqdim etmək üçün təsnif edilməmiş fraqmentləri (məsələn, proqnozlaşdırılan faqlardan, genomik adalardan və MAG-nin yenidən qurulması üçün kifayət qədər məlumat olmayan genom fraqmentlərindən) ehtiva edən bu dəniz genom resursu taksonomik məlumatlar ilə müqayisə edilə bilər. .Okean Mikrobiologiya Bazasında (OMD; https://microbiomics.io/ocean/) gen funksiyası və kontekst parametrləri ilə birlikdə annotasiyalara daxil olun.
Daha sonra açıq okean mikrobiomlarında biosintetik potensialın zənginliyini və yeniliyini araşdırmaq üçün yola çıxdıq.Bu məqsədlə biz ilk olaraq 1038 dəniz metagenomunda (metodlarda) aşkar edilmiş bütün MAG, SAG və REF-lər üçün cəmi 39,055 BGC-ni proqnozlaşdırmaq üçün antiSMASH-dan istifadə etdik.Daha sonra onları 6907 lazımsız GCF və 151 gen klasteri populyasiyasına (GCCs; Əlavə Cədvəl 2 və üsullar) qruplaşdırdıq ki, xas artıqlığı (yəni, eyni BGC çoxlu genomlarda kodlaşdırıla bilər) və konsentrasiya edilmiş BGC-lərin metagenomik məlumatlarının parçalanmasını hesaba katdıq.Natamam BGC-lər, əgər varsa (Əlavə Məlumat), 44% və 86% hallarda ən azı bir bütöv BGC üzvü olan GCF və GCC-lərin sayı əhəmiyyətli dərəcədə artmayıb.
GCC səviyyəsində biz proqnozlaşdırılan RiPPs və digər təbii məhsulların geniş çeşidini tapdıq (Şəkil 2a).Onların arasında, məsələn, arilpolienlər, karotenoidlər, ektoinlər və sideroforlar geniş filogenetik paylanmaya və okean metagenomlarında yüksək bolluğa malik olan GCC-lərə aiddir ki, bu da mikroorqanizmlərin dəniz mühitinə geniş uyğunlaşmasını, o cümlədən reaktiv oksigen növlərinə müqavimətini göstərə bilər. oksidləşdirici və osmotik stress..və ya dəmirin udulması (ətraflı məlumat).Bu funksional müxtəliflik NCBI RefSeq verilənlər bazasında (BiG-FAM/RefSeq, bundan sonra RefSeq adlandırılacaq)29 saxlanılan təxminən 190.000 genom arasında təxminən 1,2 milyon BGC-nin son təhlili ilə ziddiyyət təşkil edir, bu da ribosomal olmayan Sintetaza peptidlərinin (NR poliketidlərinin) və (PKS) BGCs (Əlavə Məlumat).Biz həmçinin hər hansı RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; Şəkil 2a və üsullar) ilə uzaqdan əlaqəli 44 (29%) GCC və yalnız MAG-də 53 (35%) GCC tapdıq və potensialı vurğuladıq. OMD-də əvvəllər təsvir olunmamış kimyəvi maddələri aşkar etmək.Bu GCC-lərin hər birinin çox müxtəlif biosintetik funksiyaları təmsil etdiyini nəzərə alaraq, oxşar təbii məhsullar üçün kodlaşdırması nəzərdə tutulan BGC-lərin daha ətraflı qruplaşdırılmasını təmin etmək məqsədilə GCF səviyyəsində məlumatları əlavə təhlil etdik29.Cəmi 3861 (56%) müəyyən edilmiş GCF-lər RefSeq ilə üst-üstə düşmədi və GCF-lərin >97%-i eksperimental olaraq təsdiqlənmiş BGC-lərin ən böyük verilənlər bazalarından biri olan MIBiG-də mövcud deyildi (Şəkil 2b).İstinad genomu ilə yaxşı təmsil olunmayan parametrlərdə bir çox potensial yeni yolları aşkar etmək təəccüblü olmasa da, müqayisə etmədən əvvəl BGC-ləri GCF-lərə silmək üçün metodumuz əvvəlki hesabatlardan fərqlənir 16 və bizə yeniliyin qərəzsiz qiymətləndirilməsini təmin etməyə imkan verir.Yeni müxtəlifliyin əksəriyyəti (3012 GCF və ya 78%) proqnozlaşdırılan terpenlərə, RiPP və ya digər təbii məhsullara uyğundur və əksəriyyəti (1815 GCF və ya 47%) biosintetik potensialına görə naməlum növlərdə kodlaşdırılmışdır.PKS və NRPS klasterlərindən fərqli olaraq, bu kompakt BGC-lərin metagenomik montaj zamanı parçalanma ehtimalı azdır 31 və onların məhsullarının daha çox vaxt və resurs tələb edən funksional xarakteristikaya imkan verir.
Cəmi 39,055 BGC 6,907 GCF və 151 GCC-də qruplaşdırılıb.a, məlumat təqdimatı (daxili xarici).GCC-ə əsaslanan BGC məsafələrinin iyerarxik qruplaşdırılması, onlardan 53-ü yalnız MAG tərəfindən müəyyən edilir.GCC müxtəlif taksonlardan (ln-çevrilmiş qapı tezliyi) və müxtəlif BGC siniflərindən (dairə ölçüsü onun tezliyinə uyğundur) BGC-ləri ehtiva edir.Hər bir GCC üçün xarici təbəqə BGC-lərin sayını, yayılmasını (nümunələrin faizini) və məsafəni (minimum BGC kosinus məsafəsini (min(dMIBiG))) BiG-FAM-dan BGC-yə qədər) təmsil edir.Eksperimental olaraq təsdiqlənmiş BGC-lərlə (MIBiG) yaxından əlaqəli BGC-ləri olan GCC-lər oxlarla vurğulanır.b GCF-ni proqnozlaşdırılan (BiG-FAM) və eksperimental olaraq təsdiqlənmiş (MIBiG) BGC-lərlə müqayisə edərək, 3861 yeni (d–>0.2) GCF aşkar edildi.Bu kodların əksəriyyəti (78%) RiPP, terpenlər və digər ehtimal olunan təbii məhsullar üçündür.c, 1038 dəniz metagenomunda tapılan OMD-dəki bütün genomlar OMD-nin filogenetik əhatəsini göstərmək üçün GTDB əsas ağacına yerləşdirildi.OMD-də heç bir genomu olmayan təbəqələr boz rəngdə göstərilir.BGC-lərin sayı müəyyən bir qrupda genom başına proqnozlaşdırılan BGC-lərin ən çox sayına uyğundur.Aydınlıq üçün, qovşaqların son 15% -i çökdü.Oklar, Mikobakteriya, Gordoniya (yalnız Rhodococcus-dan sonra ikinci) və Crocosphaera (yalnız Synechococcus-dan sonra ikinci) istisna olmaqla, BGC (>15 BGC) ilə zəngin qrupları göstərir.d, Naməlum c.Eremiobacterota ən yüksək biosintetik müxtəliflik göstərmişdir (təbii məhsul növünə əsaslanan Şennon indeksi).Hər bir zolaq növdə ən çox BGC olan genomu təmsil edir.T1PKS, PKS tip I, T2/3PKS, PKS tip II və tip III.
Zənginlik və yenilikdən əlavə, biz dəniz mikrobiomunun biosintetik potensialının biocoğrafi strukturunu araşdırırıq.Nümunələrin orta metagenomik GCF nüsxə sayı paylanmasına görə qruplaşdırılması (Metodlar) göstərdi ki, aşağı enlik, səth, prokaryotiklərlə zəngin və virus baxımından zəif icmalar, əsasən yerüstü və ya daha dərin günəş işığında olan sulardan, RiPP və BGC terpenləri ilə zəngindir.Bunun əksinə olaraq, qütb, dərin dəniz, virus və hissəciklərlə zəngin icmalar daha yüksək NRPS və PKS BGC bolluğu ilə əlaqələndirilmişdir (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 4 və əlavə məlumat).Nəhayət, yaxşı öyrənilmiş tropik və pelagik icmaların yeni terpenlərin ən perspektivli mənbələri olduğunu aşkar etdik (Genişləndirilmiş Məlumat Şəkili).PKS, RiPP və digər təbii məhsullar üçün ən yüksək potensial (genişlənmiş məlumatlarla Şəkil 5a).
Dəniz mikrobiomlarının biosintetik potensialı ilə bağlı araşdırmamızı tamamlamaq üçün onların filogenetik paylanmasını xəritələndirməyi və yeni BGC ilə zənginləşdirilmiş təbəqələri müəyyən etməyi qarşımıza məqsəd qoymuşuq.Bu məqsədlə biz dəniz mikroblarının genomlarını normallaşdırılmış GTDB13 bakterial və arxa filogenetik ağaca yerləşdirdik və onların kodladıqları ehtimal olunan biosintetik yolları örtdük (Şəkil 2c).Biz siyanobakteriyalar (Synechococcus) və Tistrella32,33 kimi Proteus bakteriyası kimi biosintetik potensialı ilə tanınan dəniz suyu nümunələrində (metodlarda) bir neçə BGC ilə zənginləşdirilmiş təbəqələri (15-dən çox BGC ilə təmsil olunur) asanlıqla aşkar etdik və ya bu yaxınlarda diqqəti cəlb etdik. təbii məhsullar.Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus və Planctomycetota34,35,36 kimi.Maraqlıdır ki, biz bu təbəqələrdə əvvəllər araşdırılmamış bir neçə nəsil tapdıq.Məsələn, Planctomycetota və Myxococcota filasında ən zəngin biosintetik potensiala malik olan növlər, müvafiq olaraq, xarakterik olmayan namizəd sıralarına və cinslərə aid idi (Əlavə Cədvəl 3).Birlikdə götürdükdə, bu, OMD-nin ferment və təbii məhsulun kəşfi üçün yeni hədəfləri təmsil edə bilən mikroorqanizmlər də daxil olmaqla, əvvəllər naməlum filogenetik məlumatlara çıxışı təmin etdiyini göstərir.
Sonra, biz BGC ilə zənginləşdirilmiş kladanı yalnız onun üzvləri tərəfindən kodlaşdırılmış BGC-lərin maksimum sayını hesablamaqla deyil, həm də müxtəlif növ təbii namizəd məhsulların tezliyini izah edən bu BGC-lərin müxtəlifliyini qiymətləndirməklə xarakterizə etdik (Şəkil 2c və üsullar). )..Biz tapdıq ki, biosintetik cəhətdən ən müxtəlif növlər bu işdə xüsusi olaraq hazırlanmış bakterial MAG-lərlə təmsil olunur.Bu bakteriyalar becərilməmiş Candidatus Eremiobacterota filumuna aiddir, bir neçə genomik tədqiqatlar istisna olmaqla, əsasən tədqiq edilməmiş qalır37,38.Maraqlıdır ki, “təq.Eremiobacterota cinsi yalnız yerüstü mühitdə təhlil edilmişdir39 və BGC ilə zənginləşdirilmiş hər hansı üzvlərin daxil olduğu məlum deyil.Burada biz eyni növdən olan səkkiz MAG-ni yenidən qurmuşuq (nukleotid eyniliyi > 99%) 23. Buna görə də biz Yunan mifologiyasında və ekspedisiyalarında gözəl bir hədiyyə olan nereidin (dəniz pərisi) adını daşıyan “Candidatus Eudoremicrobium malaspinii” növ adını təklif edirik.'Ka.Filogenetik annotasiya 13-ə əsasən, E. malaspinii-nin ardıcıllıq səviyyəsindən aşağı əvvəllər məlum qohumları yoxdur və buna görə də təklif etdiyimiz yeni bakteriya ailəsinə aiddir.E. malaspinii” tip növ kimi və “Ca.Eudormicrobiaceae” rəsmi adı (Əlavə məlumat).'Ca-nın qısa metagenomik yenidən qurulması.E. malaspinii genomu layihəsi çox aşağı giriş, uzun müddət oxunan metagenomik ardıcıllıq və 75 kb duplikasiya ilə tək 9,63 Mb xətti xromosom kimi bir nümunənin (Metodlar) məqsədyönlü yığılması ilə təsdiq edilmişdir.qalan yeganə qeyri-müəyyənlik kimi.
Bu növün filogenetik kontekstini yaratmaq üçün, hədəflənmiş genomun yenidən qurulması yolu ilə Tara Okeanı ekspedisiyasından əlavə eukaryotik zənginləşdirilmiş metagenomik nümunələrdə yaxından əlaqəli 40 növ axtardıq.Qısaca olaraq, biz metagenomik oxunuşları “Ca.E. malaspinii” və fərziyyə irəli sürdü ki, bu nümunədə işə qəbul nisbətinin artması digər qohumların (metodların) varlığını göstərir.Nəticədə, biz 10 MAG tapdıq, 19 MAG-nin birləşməsini yeni müəyyən edilmiş ailə daxilində üç cinsdə beş növü təmsil edən (yəni “Ca. Eudormicrobiaceae”).Əl ilə yoxlama və keyfiyyətə nəzarətdən sonra (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 6 və əlavə məlumat) biz tapdıq ki, “Ca.Eudormicrobiaceae növləri digər “Ca” üzvlərinə nisbətən daha böyük genomlar (8 Mb) və daha zəngin biosintetik potensial (hər növə 14-22 BGC) təqdim edir.Clade Eremiobacterota (7 BGC-ə qədər) (Şəkil 3a–c).
a, Beş 'Ca-nın filogenetik mövqeləri.Eudormicrobiaceae növləri bu tədqiqatda müəyyən edilmiş dəniz xətlərinə xas BGC zənginliyi göstərmişdir.Filogenetik ağaca bütün 'Ca daxildir.GTDB-də (versiya 89) verilmiş MAG Eremiobacterota və digər filaların üzvləri (mötərizədə genom nömrələri) təkamül fonu (Metodlar) üçün istifadə edilmişdir.Ən kənar təbəqələr ailə səviyyəsində (“Ca. Eudormicrobiaceae” və “Ca. Xenobiaceae”) və sinif səviyyəsində (“Ca. Eremiobacteria”) təsnifatları təmsil edir.Bu tədqiqatda təsvir edilən beş növ alfasayısal kodlar və təklif olunan binomial adlarla təmsil olunur (Əlavə məlumat).b, tamam.Eudormicrobiaceae növləri yeddi ümumi BGC nüvəsini bölüşür.A2 sinfində BGC-nin olmaması nümayəndə MAG-nin tam olmaması ilə əlaqədar idi (Əlavə Cədvəl 3).BGC-lər “Ca.Amphithomicrobium” və “Ca.Amphithomicrobium” (A və B təbəqələri) göstərilmir.c, Bütün BGC-lər “Ca.Eudoremicrobium taraoceanii-nin Tara okeanlarından götürülmüş 623 metatranskriptomda ifadə olunduğu aşkar edilmişdir.Qatı dairələr aktiv transkripsiyanı göstərir.Narıncı dairələr, təsərrüfat geninin ifadə sürətinin (metodlarının) altında və yuxarıda log2 ilə çevrilmiş qat dəyişikliklərini göstərir.d, 'Ca'nı göstərən nisbi bolluq əyriləri (metodlar).Eudormicrobiaceae növləri əksər okean hövzələrində və bütün su sütununda (səthdən ən azı 4000 m dərinliyə qədər) geniş yayılmışdır.Bu təxminlərə əsasən, biz 'Ca.E. malaspinii' dərin dəniz pelagik taxılla əlaqəli icmalarda prokaryotik hüceyrələrin 6%-ə qədərini təşkil edir.Biz bir növü müəyyən dərinlik qatının ölçüsünün hər hansı bir hissəsində tapılarsa, saytda mövcud hesab etdik.IO – Hind okeanı, NAO – Şimali Atlantik, NPO – Şimali Sakit okean, RS – Qırmızı dəniz, SAO – Cənubi Atlantik, SO – Cənubi Okean, SPO – Cənubi Sakit okean.
Ca bolluğunun və yayılmasının öyrənilməsi.Eudormicrobiaceae, aşkar etdiyimiz kimi, əksər okean hövzələrində, eləcə də bütün su sütununda üstünlük təşkil edir (şəkil 3d).Yerli olaraq, onlar dəniz mikrob icmasının 6%-ni təşkil edərək, onları qlobal dəniz mikrobiomunun mühüm hissəsinə çevirir.Bundan əlavə, Ca nisbi məzmununu tapdıq.Eudormicrobiaceae növləri və onların BGC ifadə səviyyələri eukaryotik zənginləşdirilmiş fraksiyada ən yüksək olmuşdur (Şəkil 3c və genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 7), plankton da daxil olmaqla hissəciklər ilə mümkün qarşılıqlı əlaqəni göstərir.Bu müşahidə 'Ca'ya bir qədər bənzəyir.Məlum yollar vasitəsilə sitotoksik təbii məhsullar istehsal edən Eudoremicrobium BGC-lər xüsusi olaraq Myxococcus41 kimi metabolitlər istehsal edən digər yırtıcılara bənzər yırtıcı davranış nümayiş etdirə bilər (Əlavə Məlumat və Genişləndirilmiş Məlumat, Şəkil 8).Ca-nın kəşfi.Prokaryotik nümunələrdən daha az mövcud olan (dərin okean) və ya eukaryotik nümunələrdəki Eudormicrobiaceae bu bakteriyaların və onların gözlənilməz BGC müxtəlifliyinin təbii qida tədqiqatı kontekstində niyə qeyri-müəyyən qaldığını izah edə bilər.
Nəhayət, biz yeni yollar, fermentlər və təbii məhsulların kəşfində mikrobioma əsaslı işimizin vədini eksperimental olaraq təsdiqləməyə çalışdıq.BGC-lərin müxtəlif sinifləri arasında RiPP yolunun yetkin fermentlər tərəfindən əsas peptidin müxtəlif post-translational modifikasiyaları səbəbindən zəngin kimyəvi və funksional müxtəlifliyi kodladığı məlumdur42.Beləliklə, biz iki 'C seçdik.Eudoremicrobium' RiPP BGC-ləri (Şəkil 3b və 4a-e) hər hansı məlum BGC (\(\bar{d}\)MIBiG və \(\bar{d}\)RefSeq 0.2-dən yuxarı) ilə eynidir.
a–c, Dərin dəniz Ca növlərinə xas olan RiPP biosintezinin yeni (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) klasterinin in vitro heteroloji ifadəsi və in vitro fermentativ analizləri.E. malaspinii' difosforilləşdirilmiş məhsulların istehsalına gətirib çıxardı.c, yüksək qətnamə (HR) MS/MS (kimyəvi strukturda b və y ionları ilə göstərilən parçalanma) və NMR (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 9) istifadə edərək müəyyən edilmiş dəyişikliklər.d, bu fosforlanmış peptid nəzarət peptidində və susuzlaşdıran peptiddə tapılmayan məməli neytrofil elastazının aşağı mikromolyar inhibisyonunu nümayiş etdirir (kimyəvi yolla çıxarılma ilə bağlı dehidrasiya).Təcrübə oxşar nəticələrlə üç dəfə təkrarlandı.Məsələn, zülal biosintezinin ikinci romanının \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) heteroloji ifadəsi 46 amin turşusu əsas peptidini dəyişdirən dörd yetkin fermentin funksiyasını aydınlaşdırır.Qalıqlar HR-MS/MS, izotop etiketləməsi və NMR analizi (Əlavə məlumat) tərəfindən proqnozlaşdırılan modifikasiya yerinə uyğun olaraq boyanır.Çizilmiş rəngləmə modifikasiyanın iki qalıqdan hər hansı birində baş verdiyini göstərir.Şəkil eyni nüvədə bütün yetkin fermentlərin fəaliyyətini göstərmək üçün çoxsaylı heteroloji konstruksiyaların məcmusudur.h, Onurğa amid N-metilasiyası üçün NMR məlumatlarının təsviri.Tam nəticələr Şəkildə göstərilmişdir.10 genişləndirilmiş data ilə.i, MIBiG 2.0 verilənlər bazasında tapılan bütün FkbM domenləri arasında yetkin FkbM protein klaster fermentinin filogenetik mövqeyi bu ailənin N-metiltransferaza aktivliyi olan bir fermentini aşkar edir (Əlavə məlumat).BGC-lərin (a, e), prekursor peptid strukturlarının (b, f) və təbii məhsulların ehtimal olunan kimyəvi strukturlarının (c, g) sxematik diaqramları göstərilmişdir.
İlk RiPP yolu (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) yalnız dərin dəniz növlərində “Ca.E. malaspinii” və Peptid- prekursorun kodları (şək. 4a, b).Bu yetkin fermentdə biz lantipeptid sintazasının dehidrasiya sahəsinə homoloji olan tək funksional domen müəyyən etdik ki, bu da normal olaraq fosforlaşmanı və 43-ün sonradan çıxarılmasını katalizləyir (Əlavə məlumat).Buna görə də, biz prekursor peptidinin modifikasiyasının belə iki mərhələli susuzlaşdırmanı ehtiva etdiyini proqnozlaşdırırıq.Bununla belə, tandem kütlə spektrometriyasından (MS/MS) və nüvə maqnit rezonans spektroskopiyasından (NMR) istifadə edərək, biz polifosforilləşdirilmiş xətti peptidi müəyyən etdik (Şəkil 4c).Gözlənilməz olsa da, biz onun son məhsul olduğunu təsdiqləyən bir neçə dəlil tapdıq: iki fərqli heteroloji host və in vitro analizlərdə dehidrasiya olmaması, yetkin fermentin katalitik dehidrasiya yerində mutasiyaya uğramış əsas qalıqların müəyyən edilməsi.hamısı “Ca” tərəfindən yenidən qurulmuşdur.E. malaspinii genomu (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 9 və əlavə məlumat) və nəhayət, fosforlanmış məhsulun bioloji fəaliyyəti, lakin kimyəvi cəhətdən sintez edilmiş susuzlaşdırılmış forma (Şəkil 4d).Əslində, ekoloji rolun hələ aydınlaşdırılmamasına baxmayaraq, konsentrasiya diapazonunda (IC50 = 14.3 μM) 44 digər əlaqəli təbii məhsullarla müqayisə edilə bilən neytrofil elastazaya qarşı aşağı mikromolyar proteaz inhibitor fəaliyyəti nümayiş etdirdiyini aşkar etdik.Bu nəticələrə əsasən, yola “fosfeptin” adını verməyi təklif edirik.
İkinci hal 'Ca'ya xas olan mürəkkəb RiPP yoludur.Eudoremicrobium cinsinin (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) təbii zülal məhsullarını kodlaşdırması proqnozlaşdırılırdı (Şəkil 4e).Bu yollar, nisbətən qısa BGC45 tərəfindən kodlanmış fermentlər tərəfindən qurulan gözlənilən sıxlıq və qeyri-adi kimyəvi modifikasiyaların müxtəlifliyinə görə xüsusi biotexnoloji maraq doğurur.Bu zülalın əvvəllər səciyyələndirilmiş zülallardan həm əsas NX5N motivi, həm də landornamidlərin lantionin halqası olmaması ilə fərqləndiyini gördük 46.Ümumi heteroloji ifadə nümunələrinin məhdudiyyətlərini aradan qaldırmaq üçün dörd yetkin yol fermentini (metodlarını) xarakterizə etmək üçün onlardan xüsusi Microvirgula aerodenitrificans sistemi ilə birlikdə istifadə etdik.MS/MS, izotop etiketləməsi və NMR birləşməsindən istifadə edərək, biz bu yetkin fermentləri peptidin 46 amin turşusu nüvəsində aşkar etdik (Şəkil 4f,g, genişləndirilmiş məlumatlar, Şəkil 10-12 və əlavə məlumat).Yetkin fermentlər arasında biz RiPP yolunda FkbM O-metiltransferaza ailəsinin 47 üzvünün ilk görünüşünü xarakterizə etdik və gözlənilmədən bu yetkin fermentin onurğa N-metilasiyasını təqdim etdiyini aşkar etdik (Şəkil 4h, i və əlavə məlumat).Bu modifikasiya təbii NRP48 məhsullarında məlum olsa da, amid bağlarının enzimatik N-metilasiyası mürəkkəb, lakin biotexnoloji cəhətdən əhəmiyyətli reaksiyadır49 ki, bu günə qədər RiPP borosinlər ailəsi üçün maraqlıdır.Xüsusiyyət 50,51.Bu fəaliyyətin digər fermentlər və RiPP ailələrində müəyyən edilməsi yeni tətbiqlər aça bilər və zülalların 52 funksional müxtəlifliyini və onların kimyəvi müxtəlifliyini genişləndirə bilər.Müəyyən edilmiş dəyişikliklərə və təklif olunan məhsul strukturunun qeyri-adi uzunluğuna əsaslanaraq, biz “pitonamid” yolunun adını təklif edirik.
Funksional olaraq xarakterizə edilən fermentlər ailəsində gözlənilməz enzimologiyanın kəşfi yeni kəşflər üçün ekoloji genomikanın vədlərini göstərir, həmçinin yalnız ardıcıllıq homologiyasına əsaslanan funksional nəticə çıxarmaq üçün məhdud imkanları göstərir.Beləliklə, qeyri-kanonik bioaktiv polifosforilləşdirilmiş RiPPs hesabatları ilə birlikdə nəticələrimiz biokimyəvi birləşmələrin funksional zənginliyini, müxtəlifliyini və qeyri-adi strukturlarını tam aşkar etmək üçün sintetik biologiya səyləri üçün resurs tutumlu, lakin kritik dəyər nümayiş etdirir.
Burada biz mikroblar tərəfindən kodlaşdırılan biosintetik potensialın diapazonunu və onların qlobal dəniz mikrobiomunda onların genomik kontekstini nümayiş etdiririk, nəticədə əldə edilən resursu elmi ictimaiyyətə təqdim etməklə gələcək tədqiqatları asanlaşdırırıq (https://microbiomics.io/ocean/).Biz tapdıq ki, onun filogenetik və funksional yeniliyinin çoxu yalnız MAG və SAG-ların yenidən qurulması ilə əldə edilə bilər, xüsusən də gələcək biokəşfiyyat səylərini istiqamətləndirə biləcək kifayət qədər istifadə olunmayan mikrob icmalarında.Baxmayaraq ki, burada diqqətimizi Ca.Eudormicrobiaceae” xüsusilə biosintetik cəhətdən “istedadlı” bir nəsil kimi kəşf edilməmiş mikrobiotada proqnozlaşdırılan BGC-lərin çoxu, ehtimal ki, ekoloji və/və ya biotexnoloji cəhətdən əhəmiyyətli təsirlərə malik birləşmələr verən əvvəllər təsvir olunmamış enzimologiyaları kodlayır.
Okean hövzələrində, dərin təbəqələrdə və zamanla qlobal dəniz mikrob icmalarının əhatə dairəsini artırmaq üçün kifayət qədər ardıcıllıq dərinliyi olan əsas okeanoqrafik və zaman seriyası tədqiqatlarından metagenomik məlumat dəstləri daxil edilmişdir.Bu məlumat dəstlərinə (Əlavə Cədvəl 1 və Şəkil 1) Tara okeanlarında (viral zənginləşdirilmiş, n=190; prokaryotik zənginləşdirilmiş, n=180)12,22 və BioGEOTRACES ekspedisiyasında (n=480) toplanmış nümunələrdən metagenomika daxildir.Havay Okean Zamanı Seriyası (HOT, n = 68), Bermud-Atlantik Zaman Seriyası (BATS, n = 62)21 və Malaspina Ekspedisiyası (n = 58)23.Bütün metagenomik fraqmentlərdən oxunuşların ardıcıllığı BBMap (v.38.71) istifadə edərək, oxunuşlardan ardıcıllıq adapterlərini çıxarmaqla, keyfiyyətə nəzarət ardıcıllığına (PhiX genomları) uyğunlaşdırılmış oxunuşları silməklə və trimq=14, maq=20 istifadə edərək, keyfiyyətsiz oxunuş keyfiyyətini ləğv edərək keyfiyyət üçün süzülüb. maxns = 0 və minlength = 45. Sonrakı təhlillər yerinə yetirildi və ya müəyyən edilərsə, QC oxunuşları ilə birləşdirildi (bbmerge.sh minoverlap=16).QC oxunuşları metaSPAdlardan istifadə edərək (lazım olduqda v.3.11.1 və ya v.3.12) qurmazdan əvvəl normallaşdırıldı (bbnorm.sh hədəfi = 40, ağıl dərinliyi = 0).Nəticədə meydana gələn iskele kontigləri (bundan sonra iskele adlandırılacaq) nəhayət uzunluğa (≥1 kb) görə süzüldü.
1038 metagenomik nümunə qruplara bölündü və hər bir nümunə qrupu üçün bütün nümunələrin metagenomik keyfiyyətə nəzarət oxunuşları hər bir nümunənin mötərizələrinə ayrı-ayrılıqda uyğunlaşdırıldı, nəticədə aşağıdakı cüt mötərizədə qrup oxunuşları əldə edildi: Tara Dəniz Virusları – Zənginləşdirilmiş (190×190 ), Zənginləşdirilmiş Prokaryotlar (180×180), BioGEOTRACEES, HOT və BATS (610×610) və Malaspina (58×58).Xəritəçəkmə Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 istifadə edərək aparılmışdır ki, bu da oxunuşları ikinci dərəcəli saytlara uyğunlaşdırmağa imkan verir (-a bayrağından istifadə etməklə).Düzəlişlər ən azı 45 əsas uzunluğunda, ≥97% eyniliyə və ≥80% oxunuş aralığına malik olmaq üçün süzülüb.Nəticədə BAM faylları hər qrup üçün nümunədaxili və nümunələrarası əhatəni təmin etmək üçün MetaBAT2 (v.2.12.1)55 üçün jgi_summarize_bam_contig_depths skripti ilə işlənmişdir.Nəhayət, MetaBAT2-ni –minContig 2000 və –maxEdges 500 ilə bütün nümunələrdə fərdi olaraq işə salmaqla həssaslığı artırmaq üçün mötərizələr qruplaşdırıldı. Biz ansambl boksçusu əvəzinə MetaBAT2-dən istifadə edirik, çünki müstəqil testlərdə ən effektiv tək boksçu olduğu göstərilmişdir.və digər tez-tez istifadə olunan boksçulardan 10-50 dəfə daha sürətlidir57.Bolluq korrelyasiyalarının təsirini yoxlamaq üçün təsadüfi seçilmiş metagenomik alt nümunə (iki Tara Okeanı məlumat dəstinin hər biri üçün 10, BioGEOTRACES üçün 10, hər zaman seriyası üçün 5 və Malaspina üçün 5) əlavə olaraq yalnız nümunələrdən istifadə etdi.Daxili nümunələr əhatə dairəsi haqqında məlumat əldə etmək üçün qruplaşdırılır.(Əlavə informasiya).
Əlavə (xarici) genomlar sonrakı təhlilə daxil edilmişdir, yəni Tara Oceans26 verilənlər dəstinin alt çoxluğundan əl ilə seçilmiş 830 MAG, GORG20 məlumat dəstindən 5287 SAG və 1707 təcrid olunmuş REF və MAR verilənlər bazasından (MarDB v. 4) məlumatlar. 682 SAGs) 27. MarDB verilənlər bazası üçün genomlar mövcud metadata əsasında seçilir, əgər nümunə növü aşağıdakı normal ifadəyə uyğun gəlir: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]kulture| [I|i] təcrid olunmuş'.
Hər bir metagenomik konteynerin və xarici genomların keyfiyyəti CheckM (v.1.0.13) və Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59 istifadə edərək qiymətləndirilmişdir.CheckM və ya Anvi'o ≥50% tamlıq/tamlıq və ≤10% çirklənmə/ehtiyatlıq haqqında məlumat verirsə, metagenomik hüceyrələri və xarici genomları sonrakı analiz üçün saxlayın.Daha sonra bu ballar icma meyarlarına60 uyğun olaraq genom keyfiyyətini aşağıdakı kimi təsnif etmək üçün orta tamlıq (mcpl) və orta çirklənməyə (mctn) birləşdirildi: yüksək keyfiyyət: mcpl ≥ 90% və mctn ≤ 5%;yaxşı keyfiyyət: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, orta keyfiyyət: mcpl ≥ 50% və mctn ≤ 10%, ədalətli keyfiyyət: mcpl ≤ 90% və ya mctn ≥ 10%.Sonra süzülmüş genomlar keyfiyyət balları ilə (Q və Q') aşağıdakı kimi əlaqələndirildi: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (gərginlik dəyişkənliyi)/100 + 0.5 x log[N50] .(dRep61-də həyata keçirilir).
Müxtəlif məlumat mənbələri və genom növləri (MAG, SAG və REF) arasında müqayisəli təhlilə imkan vermək üçün dRep (v.2.5.4) istifadə edərək, genom üzrə orta nukleotid eyniliyinə (ANI) əsasən 34,799 genomun istinadı ləğv edildi.Təkrarlar)61 95% ANI hədləri ilə28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) və növ səviyyəsində genom qruplaşmasını təmin edən SpecI63 istifadə edən tək surətli marker genləri.Hər bir dRep klasteri üçün yuxarıda müəyyən edilmiş maksimum keyfiyyət balına (Q') uyğun olaraq reprezentativ genom seçilmişdir ki, bu da növün nümayəndəsi hesab olunur.
Xəritəçəkmə sürətini qiymətləndirmək üçün BWA (v.0.7.17-r1188, -a) OMD-də olan 34,799 genomu olan bütün 1038 metagenomik oxunuşların xəritələşdirilməsi üçün istifadə edilmişdir.Keyfiyyətə nəzarət edilən oxunuşlar tək uçlu rejimdə xəritələndi və nəticədə düzülmələr yalnız ≥45 bp uzunluğunda düzülmələri saxlamaq üçün süzüldü.və şəxsiyyət ≥95%.Hər bir nümunə üçün ekran nisbəti filtrasiyadan sonra qalan oxunuşların keyfiyyətə nəzarət oxunuşlarının ümumi sayına bölünməsidir.Eyni yanaşmadan istifadə edərək, 1038 metagenomun hər biri 5 milyon əlavəyə endirildi (genişlənmiş məlumat, Şəkil 1c) və OMD-də və bütün GEM16-da GORG SAG ilə uyğunlaşdırıldı.GEM16 kataloqunda dəniz suyundan əldə edilən MAG-lərin miqdarı, dəniz suyu nümunələrinin seçilməsi (məsələn, dəniz çöküntülərindən fərqli olaraq) metagenomik mənbələrin açar söz sorğuları ilə müəyyən edilmişdir.Konkret olaraq, biz “ekosistem_kateqoriyası” kimi “sucul”u, “ekosistem_növü” kimi “dəniz”i, “habitat”ı isə “dərin okean”, “dəniz”, “dəniz okeanı”, “pelagik dəniz”, “dəniz suyu” kimi süzürük, “Okean”, “Dəniz suyu”, “Yerüstü dəniz suyu”, “Yerüstü dəniz suyu”.Bu, 1823 OTU üzərində paylanmış 5903 MAG (734 yüksək keyfiyyətli) ilə nəticələndi (burada baxılır).
Prokaryotik genomlar GTDB-Tk (v.1.0.2)64 istifadə edərək, GTDB r89 versiyası 13-ü hədəfləyən standart parametrlərlə taksonomik olaraq şərh edilmişdir. Anvi'o domen proqnozu və geri çağırma ≥50% və artıqlıq ≤ 10% əsasında eukaryotik genomları müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir.Bir növün taksonomik annotasiyası onun təmsilçi genomlarından biri kimi müəyyən edilir.Eukaryotlar (148 MAG) istisna olmaqla, hər bir genom ilk olaraq prokka (v.1.14.5)65 istifadə edərək funksional olaraq şərh edildi, tam genləri adlandırdı, lazım olduqda “arxeya” və ya “bakteriya” parametrlərini təyin etdi, bu da qeyri-adekvatlar üçün də bildirilir. kodlayan genlər.və CRISPR bölgələri, digər genomik xüsusiyyətlər arasında.fetchMG (v.1.2)66 istifadə edərək universal tək nüsxəli marker genlərini (uscMG) müəyyən edərək proqnozlaşdırılan genlərə şərh yazın, ortoloji qruplar təyin edin və eggNOG (v.5.0)68 əsasında emapper (v.2.0.1)67 istifadə edərək sorğu edin.KEGG verilənlər bazası (10 fevral 2020-ci ildə dərc edilib) 69. Son addım sorğu və mövzu əhatəsi ≥70% olan DIAMOND (v.0.9.30)70 istifadə edərək zülalların KEGG verilənlər bazasına uyğunlaşdırılması ilə həyata keçirilib.Nəticələr NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71-ə uyğun olaraq maksimum gözlənilən bit sürətinin ≥ 50% bit sürətinə (linkin özü) əsaslanaraq daha sonra süzüldü.Defolt parametrləri və müxtəlif klaster partlayışları ilə antiSMASH (v.5.1.0)72 istifadə edərək genomdakı BGC-ləri müəyyən etmək üçün gen ardıcıllıqları da giriş kimi istifadə edilmişdir.Bütün genomlar və annotasiyalar internetdə mövcud olan kontekstual metadata ilə birlikdə OMD-də tərtib edilmişdir (https://microbiomics.io/ocean/).
Daha əvvəl təsvir edilmiş metodlara bənzər12,22 biz OMD-dən bakterial və arxa genomlardan >56,6 milyon protein kodlayan genləri 95% eyniliyə və daha qısa genlərə (90% əhatə dairəsi)73 klaster etmək üçün CD-HIT (v.4.8.1) istifadə etdik. >17,7 milyon gen klasteri.Ən uzun ardıcıllıq hər bir gen klasteri üçün reprezentativ gen kimi seçilmişdir.Daha sonra 1038 metagenom >17,7 milyon BWA (-a) klaster üzvlərinə uyğunlaşdırıldı və nəticədə əldə edilən BAM faylları yalnız ≥95% eynilik və ≥45 baza düzülüşü ilə düzülmələri saxlamaq üçün süzüldü.Uzunluqla normallaşdırılmış gen bolluğu əvvəlcə ən yaxşı unikal uyğunlaşmadan əlavələrin sayılması və sonra qeyri-səlis xəritələnmiş əlavələr üçün unikal əlavələrin sayına mütənasib olaraq müvafiq hədəf genlərə fraksiya saylarının əlavə edilməsi ilə hesablanmışdır.
Genişləndirilmiş OMD-dən olan genomlar (“Ca. Eudormicrobiaceae”dən əlavə MAG-lərlə, aşağıya baxın) genişləndirilmiş MOTU istinad bazası yaratmaq üçün mOTUs74 metagenomik analiz aləti verilənlər bazasına (v.2.5.1) əlavə edildi.On uscMG-dən yalnız altı tək nüsxəli genom (23.528 genom) sağ qaldı.Verilənlər bazasının genişləndirilməsi növlər səviyyəsində 4,494 əlavə klasterlə nəticələndi.1038 metagenom standart mOTU parametrləri (v.2) istifadə edərək təhlil edilmişdir.644 mOTU klasterində olan cəmi 989 genom (95% REF, 5% SAG və 99,9% MarDB-yə aiddir) mOTU profili tərəfindən aşkar edilməmişdir.Bu, MarDB genomlarının dəniz təcridinin müxtəlif əlavə mənbələrini əks etdirir (açıqlanmamış genomların əksəriyyəti çöküntülərdən, dəniz sahiblərindən və s. təcrid olunmuş orqanizmlərlə bağlıdır).Bu tədqiqatda açıq okean mühitinə diqqət yetirməyə davam etmək üçün biz onları aşkar edilmədikcə və ya bu tədqiqatda yaradılmış genişləndirilmiş MOTU verilənlər bazasına daxil edilmədikcə, aşağı axın analizindən çıxardıq.
OMD-də MAG, SAG və REF-dən olan bütün BGC-lər (yuxarıya bax) bütün metagenomik skafoldlarda (antiSMASH v.5.0, standart parametrlər) müəyyən edilmiş BGC-lərlə birləşdirilib və BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM domeni )75 ilə xarakterizə edilib.Bu xüsusiyyətlərə əsaslanaraq, BGC-lər arasındakı bütün kosinus məsafələrini hesabladıq və müvafiq olaraq 0.2 və 0.8 məsafə hədlərindən istifadə edərək onları (orta bağlantıları) GCF və GCC-də qruplaşdırdıq.Bu həddlər əvvəllər Evklid məsafəsindən75 istifadə edərək kosinus məsafəsi ilə birlikdə istifadə edilmiş hədlərin uyğunlaşdırılmasıdır ki, bu da orijinal BiG-SLICE klasterləşdirmə strategiyasındakı səhvlərin bir hissəsini yüngülləşdirir (Əlavə məlumat).
Daha sonra BGC-lər daha əvvəl təsvir edildiyi kimi parçalanma riskini azaltmaq üçün16 və 1038 metagenomda tapılmayan MarDB REF və SAG-ları (yuxarıya bax) istisna etmək üçün iskelelərdə kodlanmış yalnız ≥5 kb saxlamaq üçün süzüldü.Bu, cəmi 39,055 BGC-nin OMD genomu tərəfindən kodlanması ilə nəticələndi, əlavə 14,106 metagenomik fraqmentlərdə müəyyən edildi (yəni MAG-lərə birləşdirilməyib).Bu "metagenomik" BGC-lər verilənlər bazasında tutulmayan dəniz mikrobiomunun biosintez potensialının nisbətini qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir (Əlavə məlumat).Hər bir BGC, BiG-SCAPE76-da müəyyən edilmiş anti-SMASH və ya daha qaba məhsul kateqoriyaları ilə müəyyən edilmiş proqnozlaşdırılan məhsul növlərinə uyğun olaraq funksional olaraq xarakterizə edilmişdir.Kəmiyyət təyinində seçmə qərəzinin qarşısını almaq üçün (GCC/GCF-nin taksonomik və funksional tərkibi, GCF və GCC-nin istinad verilənlər bazalarına olan məsafəsi və GCF-nin metagenomik bolluğu) hər növ üçün yalnız ən uzun BGC-ni saxlamaqla, 39,055 BGC daha da təkmilləşdirildi, nəticədə cəmi 17,689 BGC əldə edildi.
GCC və GCF-nin yeniliyi hesablanmış verilənlər bazası (BiG-FAM-da RefSeq verilənlər bazası)29 və eksperimental olaraq yoxlanılmış (MIBIG 2.0)30 BGC arasındakı məsafəyə əsasən qiymətləndirilmişdir.17,689 təmsilçi BGC-nin hər biri üçün müvafiq verilənlər bazasına ən kiçik kosinus məsafəsini seçdik.Bu minimum məsafələr müvafiq olaraq GCF və ya GCC-ə uyğun olaraq orta (orta) alınır.Əgər verilənlər bazasına olan məsafə 0,2-dən çox olarsa, bu, (orta) GCF ilə istinad arasında ideal ayrılığa uyğundursa, GCF yeni sayılır.GCC üçün bağlantılarla uzunmüddətli əlaqəni bağlamaq üçün GCF tərəfindən müəyyən edilmiş hədddən iki dəfə çox olan 0.4-ü seçirik.
BGC-nin metagenomik bolluğu, gen səviyyəli profillərdən əldə edilən biosintetik genlərinin (anti-SMASH tərəfindən müəyyən edildiyi kimi) orta bolluğu kimi qiymətləndirildi.Hər bir GCF və ya GCC-nin metagenomik bolluğu daha sonra təmsil olunan BGC-lərin cəmi kimi hesablandı (17,689-dan).Bu bolluq xəritələri sonradan nümunə başına mOTU sayından istifadə edərək hüceyrə tərkibi üçün normallaşdırıldı, bu da ardıcıllıq səylərini hesaba aldı (genişlənmiş məlumatlar, Şəkil 1d).GCF və ya GCC-nin yayılması bolluğu > 0 olan nümunələrin faizi kimi hesablanmışdır.
Nümunələr arasındakı Evklid məsafəsi normallaşdırılmış GCF profilindən hesablanmışdır.Bu məsafələr UMAP77 istifadə edərək ölçüdə azaldılmış və nəticədə daxiletmələr HDBSCAN78 istifadə edərək nəzarətsiz sıxlığa əsaslanan klasterləşmə üçün istifadə edilmişdir.HDBSCAN tərəfindən istifadə olunan klaster üçün optimal minimum xal sayı (və beləliklə, klasterlərin sayı) klaster üzvlüyünün məcmu ehtimalını maksimuma çatdırmaqla müəyyən edilir.Müəyyən edilmiş çoxluqlar (və bu qrupların təsadüfi balanslaşdırılmış alt nümunəsi permutasiya çoxdəyişənli dispersiya təhlilində (PERMANOVA) qərəzliliyi nəzərə almaq üçün) PERMANOVA istifadə edərək azaldılmamış Evklid məsafələrinə qarşı əhəmiyyəti üçün sınaqdan keçirilmişdir.Nümunələrin orta genom ölçüsü mOTU-nun nisbi bolluğuna və genom üzvlərinin təxmin edilən genom ölçüsünə əsasən hesablanmışdır.Xüsusilə, hər bir mOTU-nun orta genom ölçüsü onun üzvlərinin tamlıq üçün korrektə edilmiş genom ölçülərinin ortalaması kimi qiymətləndirilmişdir (süzgəcdən sonra) (məsələn, uzunluğu 3 Mb olan 75% tam genomun düzəldilmiş ölçüsü 4-ə malikdir). Mb).tamlığı ≥70% olan orta genomlar üçün.Daha sonra hər bir nümunə üçün orta genom ölçüsü nisbi bolluqla ölçülən mOTU genom ölçülərinin cəmi kimi hesablandı.
OMD-də genomla kodlanmış BGC-lərin süzülmüş dəsti bakterial və arxaeal GTDB ağaclarında (≥5 kb çərçivələrdə, 1038 metagenomda tapılmayan REF və SAG MarDB istisna olmaqla, yuxarıya baxın) və onların filogenetik əsasında proqnozlaşdırılan məhsul kateqoriyaları göstərilir. genomun mövqeyi (yuxarıya bax).Biz əvvəlcə həmin növdə ən çox BGC olan genomu təmsilçi olaraq istifadə edərək, məlumatları növlər üzrə azaltdıq.Vizuallaşdırma üçün nümayəndələr daha da ağac qruplarına bölündü və yenə də hər bir hüceyrəli təbəqə üçün ən çox BGC-ni ehtiva edən genom nümayəndə olaraq seçildi.BGC ilə zənginləşdirilmiş növlər (>15 BGC-yə malik ən azı bir genom) həmin BGC-lərdə kodlanmış məhsul növləri üçün Şennon Müxtəliflik İndeksini hesablamaqla əlavə təhlil edilmişdir.Bütün proqnozlaşdırılan məhsul növləri eyni olarsa, kimyəvi hibridlər və digər kompleks BGC-lər (anti-SMAH tərəfindən proqnozlaşdırıldığı kimi) qrupdakı sıralarından (məsələn, zülal-bakteriosin və bakteriosin-proteoprotein birləşməsindən) asılı olmayaraq eyni məhsul növünə aid edilir. bədən).hibrid).
SAMN05421555 bioloji nümunəsinə uyğun gələn və qısa oxumaq üçün Illumina SRR3962772 metagenomik oxu dəstinə uyğun gələn Malaspina nümunəsindən MP1648 nümunəsindən qalan DNT (6 ng kimi təxmin edilir, PacBio sıralama protokoluna uyğun olaraq PacBio sıralama protokoluna uyğun olaraq işlənir ki, PacSMNA ambellio nümunəsindən istifadə etmək üçün ultra-aşağı daxiletmə) dəst (100-980-000) və SMRTbell Express 2.0 şablon hazırlama dəsti (100-938-900).Qısaca olaraq, qalan DNT Covaris (g-TUBE, 52104) istifadə edərək kəsildi, təmir edildi və təmizləndi (ProNex muncuqları).Təmizlənmiş DNT daha sonra yekun təmizləmə addımından (ProNex muncuqları) və Sequel II platformasında ardıcıllıqdan əvvəl kitabxananın hazırlanmasına, gücləndirilməsinə, təmizlənməsinə (ProNex muncuqları) və ölçü seçiminə (>6 kb, Blue Pippin) məruz qalır.
İlk ikisinin yenidən qurulması təxminən.MAG Eremiobacterota üçün biz altı əlavə ANI-ni >99% müəyyən etdik (bunlar Şəkil 3-ə daxil edilib), onlar ilkin olaraq çirklənmə balları əsasında süzülüblər (sonradan genlərin təkrarlanması kimi müəyyən edilib, aşağıya baxın).“Ca” etiketli bir qab da tapdıq.Eremiobacterota” müxtəlif tədqiqatlardan23 və onları bizim tədqiqatımızdan səkkiz MAG ilə birlikdə aşağı nümunə üçün BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, – bayraq) istifadə edən 633 eukaryotik zənginləşdirilmiş (>0,8 µm) nümunədən metagenomik oxunuşlar üçün istinad kimi istifadə etdi. Xəritəçəkmə (5 milyon oxunuş).Zənginləşdirmə üçün xüsusi xəritələrə (95% uyğunlaşma eyniliyi və 80% oxu əhatəsi ilə süzülüb) əsaslanaraq montaj üçün 10 metagenom (gözlənilən əhatə dairəsi ≥5×) və məzmun korrelyasiyası üçün əlavə 49 metagenom (gözlənilən əhatə dairəsi ≥1×) seçilmişdir.Yuxarıdakı kimi eyni parametrlərdən istifadə edərək, bu nümunələr birləşdirilmiş və 10 əlavə 'Ca əlavə edilmişdir.MAG Eremiobacterota bərpa edildi.Bu 16 MAG (bazada olan ikisini saymadan) genişləndirilmiş OMD-dəki genomların ümumi sayını 34,815-ə çatdırır.MAG-lərə onların genomik oxşarlığına və GTDB-dəki mövqeyinə görə taksonomik dərəcələr verilir.18 MAG dRep istifadə edərək eyni ailə daxilində 5 növə (intraspesifik ANI >99%) və 3 nəsilə (intragenerik ANI 85% - 94%) bölünmüşdür79.Növlərin nümayəndələri bütövlük, çirklənmə və N50 əsasında əl ilə seçilmişdir.Təklif olunan nomenklatura Əlavə Məlumatda verilmişdir.
'Ca-nın bütövlüyünü və çirklənməsini qiymətləndirin.MAG Eremiobacterota, biz uscMG-nin, həmçinin CheckM və Anvi'o tərəfindən istifadə olunan nəsil və domenə xas tək surətli marker gen dəstlərinin mövcudluğunu qiymətləndirdik.40 uscMG-dən 2 dublikatın identifikasiyası hər hansı potensial çirklənməni istisna etmək üçün filogenetik rekonstruksiya (aşağıya bax) ilə təsdiq edilmişdir (bu, bu 40 marker gen əsasında 5%-ə uyğundur).Beş nümayəndəsi MAG-nin əlavə bir araşdırması 'Ca.Bu yenidən qurulmuş genomlarda çirkləndiricilərin aşağı səviyyəsi bolluq və ardıcıllıq tərkibi korrelyasiyalarına əsaslanan interaktiv Anvi'o interfeysindən istifadə edərək Eremiobacterota növləri üçün təsdiq edilmişdir (Əlavə məlumat)59.
Filogenomik analiz üçün beş təmsilçi MAG "Ca" seçdik.Eudormicrobiaceae”, bütün növlər “Ca.Eremiobacterota və digər fila üzvlərinin (UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria və Planctomycetota daxil olmaqla) genomu GTDB (r89)13-dən əldə edilə bilər.Bu genomların hamısı əvvəllər tək nüsxə marker geninin çıxarılması və BGC annotasiyası üçün təsvir edildiyi kimi qeyd edilmişdir.GTDB genomları yuxarıda göstərilən bütövlük və çirklənmə meyarlarına uyğun olaraq qorunub saxlanılmışdır.Filogenetik analiz Anvi'o Phylogenetics59 iş axınından istifadə etməklə aparılmışdır.Ağac, Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81 tərəfindən müəyyən edilmiş 39 tandem ribosom zülalının düzülüşündə IQTREE (v.2.0.3) (defolt seçimlər və -bb 1000)80 istifadə edərək qurulmuşdur.Vəzifələri azaldıldı.genomun ən azı 50%-ni əhatə etmək üçün82 və Planctomycecota GTDB ağac topologiyasına əsaslanan kənar qrup kimi istifadə edilmişdir.40 uscMGs-dən ibarət bir ağac eyni alətlər və parametrlərdən istifadə edərək tikilmişdir.
Biz ümumi mikrob əlamətlərini proqnozlaşdırmaq üçün standart parametrlərlə (fenotip, nukleotidlərdən)83 Traitardan (v.1.1.2) istifadə etdik.Biz genomda zülal kodlaşdıran genin məzmunundan asılı olan əvvəllər hazırlanmış yırtıcı indeks84 əsasında potensial yırtıcı həyat tərzini araşdırdıq.Xüsusilə, biz DIAMOND-dan genomdakı zülalları OrthoMCL verilənlər bazası (v.4)85 ilə müqayisə etmək üçün istifadə edirik –daha həssas –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 VƏ müvafiq genləri sayırıq. yırtıcılar və yırtıcı olmayanlar üçün marker genləri.İndeks yırtıcı və yırtıcı olmayan işarələrin sayı arasındakı fərqdir.Əlavə nəzarət olaraq biz “Ca” genomunu da təhlil etdik.Entotheonella TSY118 faktoru onun Ca ilə əlaqəsinə əsaslanır.Eudoremicrobium (böyük genom ölçüsü və biosintetik potensial).Sonra, yırtıcı və yırtıcı olmayan marker genləri və Ca-nın biosintetik potensialı arasında potensial əlaqələri sınaqdan keçirdik.Eudormicrobiaceae” və birdən çox genin (hər hansı bir marker genindən, yəni yırtıcı/qeyri-yırtıcı gen) BGC ilə üst-üstə düşdüyünü aşkar etdi və bu, BGC-nin yırtıcılıq siqnallarını qarışdırmadığını göstərir.Şişmiş replikonların əlavə genomik annotasiyası TXSSCAN (v.1.0.2) istifadə edərək ifrazat sistemini, pili və flagella86-nı xüsusi olaraq yoxlamaq üçün yerinə yetirilmişdir.
Tara okeanlarının prokaryotik və eukaryotik zənginləşdirmə fraksiyalarından 623 metatranskriptomun xəritələşdirilməsi yolu ilə beş təmsilçi "Ca" xəritəsi çəkildi22,40,87 (BWA, v.0.7.17-r1188, -a bayraqdan istifadə etməklə).Eudormicrobiaceae genomu.BAM faylları 80% oxu əhatə dairəsi və 95% identifikasiya filtrindən sonra FeatureCounts (v.2.0.1)88 ilə işlənmişdir (variantları ilə FeatureCounts –əsas -O –fraksiya -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) gen başına əlavələrin sayı.Yaradılmış xəritələr gen uzunluğu və marker gen bolluğu mOTU (daxiletmə sayı >0 olan genlər üçün uzunluqla normallaşdırılmış orta daxiletmə sayı) üçün normallaşdırıldı və hər bir gen səviyyəsinin hüceyrə başına nisbi ifadəsini əldə etmək üçün log-22.74-ə çevrildi, bu da ardıcıllıq zamanı nümunədən nümunəyə dəyişkənlik.Bu cür nisbətlər müqayisəli təhlilə imkan verir, nisbi bolluq məlumatlarından istifadə edərkən kompozisiya problemlərini yüngülləşdirir.Yalnız 10 mOTU marker genindən >5 olan nümunələr, genomun kifayət qədər böyük hissəsinin aşkarlanmasına imkan vermək üçün əlavə analiz üçün nəzərdən keçirilmişdir.
'Ca'nın normallaşdırılmış transkriptom profili.E. taraoceanii UMAP istifadə edərək ölçülərin azaldılmasına məruz qaldı və nəticədə təqdimat ifadə statusunu müəyyən etmək üçün HDBSCAN istifadə edərək (yuxarıya bax) nəzarətsiz qruplaşma üçün istifadə edildi.PERMANOVA orijinal (azaldılmamış) məsafə məkanında müəyyən edilmiş çoxluqlar arasındakı fərqlərin əhəmiyyətini yoxlayır.Bu şərtlər arasında diferensial ifadə genom üzrə sınaqdan keçirildi (yuxarıya bax) və 201 KEGG yolu 6 funksional qrupda müəyyən edildi, yəni: BGC, TXSSCAN-dan ifrazat sistemi və bayraqlı genlər, deqradasiya fermentləri (proteaz və peptidazlar), yırtıcı və qeyri- yırtıcı genlər.yırtıcı indeks markerləri.Hər bir nümunə üçün biz hər bir sinif üçün median normallaşdırılmış ifadəni hesabladıq (qeyd edək ki, BGC ifadəsinin özü həmin BGC üçün biosintetik genlərin median ifadəsi kimi hesablanır) və dövlətlər arasında əhəmiyyəti üçün sınaqdan keçirildi (FDR üçün düzəliş edilmiş Kruskal-Wallis testi).
Sintetik genlər GenScript-dən, PCR primerləri isə Microsynth-dən alınıb.DNT amplifikasiyası üçün Thermo Fisher Scientific-dən pusion polimeraza istifadə edilmişdir.DNT-nin təmizlənməsi üçün Macherey-Nagel-dən NucleoSpin plazmidləri, NucleoSpin gel və PCR təmizləmə dəsti istifadə edilmişdir.Məhdudiyyət fermentləri və T4 DNT liqazı New England Biolabs-dan alınıb.İzopropil-β-d-1-tioqalaktopiranozid (IPTG) (Biosinth) və 1,4-ditiotreitoldan (DTT, AppliChem) başqa kimyəvi maddələr Sigma-Aldrich-dən alınmış və əlavə təmizlənmədən istifadə edilmişdir.Xloramfenikol (Cm), spektinomisin dihidroxlorid (Sm), ampisilin (Amp), gentamisin (Gt) və karbenisilin (Cbn) antibiotikləri AppliChem-dən alınıb.Bacto Tryptone və Bacto May Extract media komponentləri BD Biosciences-dən alınmışdır.Ardıcıllıq üçün tripsin Promega-dan alınıb.
Gen ardıcıllığı anti-SMASH proqnozlaşdırılan BGC 75.1-dən çıxarılıb.E. malaspinii (Əlavə məlumat).
EmbA genləri (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gen_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) və embAM (o cümlədən intergen bölgələri) sintetikləşmiş və optimallaşdırılmış ardıcıllıqla pUCR7 ilə əlaqələndirilmişdir. E ilə ifadə üçün d nə vaxt.embA geni BamHI və HindIII parçalanma sahələri ilə pACYCDuet-1(CmR) və pCDFDuet-1(SmR)-nin ilk çoxsaylı klonlama sahəsinə (MCS1) subklonlaşdırıldı.embM və embMopt genləri (kodonla optimallaşdırılmış) BamHI və HindIII ilə MCS1 pCDFDuet-1(SmR)-ə subklonlaşdırıldı və pCDFDuet-1(SmR) və pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) ilə ikinci çoxsaylı klonlama sahəsinə yerləşdirildi. NdeI/ChoI.embAM kaseti BamHI və HindIII parçalanma yerləri ilə pCDFDuet1(SmR)-a subklonlaşdırıldı.orf3/embI geni (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) EmbI_OE_F_NdeI və EmbI_OE_R_XhoI primerlərindən istifadə edərək üst-üstə düşən PCR ilə qurulmuş, NdeI/XhoMCC ilə həzm edilmiş və eyni pDF-XhoI-yə daxil edilmişdir. məhdudlaşdırıcı fermentlər (əlavə cədvəl).6).Məhdudiyyət fermentinin həzmi və bağlanması istehsalçının protokoluna (New England Biolabs) uyğun olaraq həyata keçirilmişdir.