304 paslanmayan polad boru kəmərinin kimyəvi komponenti, SPACA6 ektodomeninin strukturu gamet birləşməsi ilə əlaqəli qorunan zülalların super ailəsini ehtiva edir.

Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.Siz məhdud CSS dəstəyi ilə brauzer versiyasından istifadə edirsiniz.Ən yaxşı təcrübə üçün sizə yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyi tövsiyə edirik (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq rejimini söndürün).Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün biz saytı üslub və JavaScript olmadan göstəririk.
Hər slaydda üç məqalə göstərən slayderlər.Slaydlar arasında hərəkət etmək üçün geri və sonrakı düymələrdən və ya hər slaydda hərəkət etmək üçün sonundakı slayd nəzarətçi düymələrindən istifadə edin.

SPACA6, məməlilərin cinsi çoxalması zamanı gamet birləşmələri üçün vacib olan sperma ilə ifadə olunan səth zülalıdır.Bu fundamental rola baxmayaraq, SPACA6-nın spesifik funksiyası zəif başa düşülür.SPACA6-nın hüceyrədənkənar sahəsinin kristal quruluşunu 2.2 Å qətnamə ilə aydınlaşdırırıq, dörd telli bağlamadan və kvazi-çevik bağlayıcılarla birləşdirilmiş Ig-yə bənzər β-sendviçlərdən ibarət iki domenli zülal aşkar edirik.Bu struktur IZUMO1-ə bənzəyir, digər gamet sintezi ilə əlaqəli zülal SPACA6 və IZUMO1-i burada IST super ailəsi kimi istinad edilən gübrələmə ilə əlaqəli zülalların super ailəsinin qurucu üzvlərinə çevirir.IST super ailəsi struktur olaraq onun bükülmüş dörd sarmal dəstəsi və bir cüt disulfidlə əlaqəli CXXC motivləri ilə müəyyən edilir.İnsan proteomunun struktur əsaslı AlphaFold axtarışı bu super ailənin əlavə zülal üzvlərini müəyyən etdi;xüsusilə, bu zülalların çoxu gamet birləşməsində iştirak edir.SPACA6 strukturu və onun IST super ailəsinin digər üzvləri ilə əlaqəsi məməlilərin gametlərinin birləşməsinə dair biliklərimizdə çatışmayan əlaqəni təmin edir.
Hər bir insanın həyatı iki ayrı haploid gametlə başlayır: atanın sperması və ananın yumurtası.Bu sperma intensiv seçim prosesinin qalibidir, bu müddət ərzində milyonlarla sperma hüceyrəsi qadın cinsiyyət yolundan keçərək müxtəlif maneələri aşaraq1 və kapasitasiyaya məruz qalır ki, bu da onların hərəkətliliyini və səth komponentləri prosesini artırır2,3,4.Sperma və yumurta hüceyrəsi bir-birini tapsa belə, proses hələ bitməyib.Oosit cumulus hüceyrələri təbəqəsi və zona pellucida adlanan qlikoprotein baryeri ilə əhatə olunmuşdur ki, sperma yumurta hüceyrəsinə daxil olmaq üçün keçməlidir.Spermatozoa bu son maneələri aradan qaldırmaq üçün səthə yapışma molekulları və membranla əlaqəli və ifraz olunan fermentlərin birləşməsindən istifadə edir5.Bu molekullar və fermentlər əsasən daxili membranda və akrosomal matrisdə saxlanılır və akrosomal reaksiya zamanı spermanın xarici qişasının parçalanması zamanı aşkar edilir6.Bu gərgin səyahətin son mərhələsi iki hüceyrənin membranlarını birləşdirərək tək diploid orqanizmə çevrildiyi sperma-yumurta birləşməsidir7.Baxmayaraq ki, bu proses insan çoxalmasında yenilikçi olsa da, zəruri molekulyar qarşılıqlı təsirlər zəif başa düşülür.
Qametlərin mayalanması ilə yanaşı, iki lipid ikiqatının birləşməsinin kimyası da geniş şəkildə öyrənilmişdir.Ümumiyyətlə, membranın birləşməsi enerji baxımından əlverişsiz bir prosesdir və zülal katalizatorunun iki membranı bir-birinə yaxınlaşdıran, onların davamlılığını pozan və birləşməyə səbəb olan struktur uyğunlaşma dəyişikliyinə məruz qalmasını tələb edir8,9.Bu protein katalizatorları fuzogenlər kimi tanınır və saysız-hesabsız birləşmə sistemlərində tapılıb.Onlar ana hüceyrələrə virusun daxil olması üçün tələb olunur (məsələn, HİV-1-də gp160, koronaviruslarda sünbül, qrip viruslarında hemaqlütinin)10,11,12 plasental (sinsitin)13,14,15 və aşağı eukaryotlarda gamet əmələ gətirən birləşmələr ( Bitkilərdə, protistlərdə və artropodlarda HAP2/GCS1) 16,17,18,19.İnsan gametləri üçün fusogenlər hələ kəşf edilməmişdir, baxmayaraq ki, bir neçə zülalın gamet bağlanması və birləşməsi üçün kritik olduğu göstərilmişdir.Siçan və insan gametlərinin birləşməsi üçün lazım olan transmembran zülal olan oositlə ifadə edilən CD9, ilk kəşf edilən 21,22,23 idi.Onun dəqiq funksiyası qeyri-müəyyən olsa da, yapışmada rolu, yumurta mikrovillilərindəki yapışma ocaqlarının strukturu və/yaxud oosit səthi zülallarının düzgün lokalizasiyası 24,25,26 görünür.Qametlərin birləşməsi üçün vacib olan ən tipik iki zülal sperma zülalı IZUMO127 və oosit zülalı JUNO28-dir və onların qarşılıqlı əlaqəsi gametlərin tanınması və birləşmədən əvvəl yapışmasında mühüm addımdır.Erkək Izumo1 nokaut siçanları və dişi Juno nokaut siçanları tamamilə sterildir, bu modellərdə sperma perivitellin boşluğuna daxil olur, lakin gametlər birləşmir.Eynilə, insan in vitro gübrələmə təcrübələrində gametlər anti-IZUMO1 və ya JUNO27,29 antikorları ilə müalicə edildikdə birləşmə azaldı.
Bu yaxınlarda fenotipik olaraq IZUMO1 və JUNO20,30,31,32,33,34,35-ə bənzəyən sperma ilə ifadə olunan zülalların yeni kəşf edilmiş qrupu aşkar edilmişdir.Sperma akrosomal membranla əlaqəli zülal 6 (SPACA6) geniş miqyaslı fare mutagenezi tədqiqatında mayalanma üçün vacib olduğu müəyyən edilmişdir.Transgenin Spaca6 geninə daxil edilməsi əriməyən spermatozoidlər əmələ gətirir, baxmayaraq ki, bu spermatozoidlər perivitellin boşluğuna sızır 36 .Siçanlarda sonrakı nokaut tədqiqatları, Spaca6-nın gamet sintezi üçün lazım olduğunu təsdiqlədi 30,32 .SPACA6, demək olar ki, yalnız testislərdə ifadə edilir və IZUMO1-ə bənzər lokalizasiya modelinə malikdir, yəni akrosomal reaksiyadan əvvəl spermatozoidlərin intiması daxilində və sonra akrosomal reaksiyadan sonra ekvator bölgəsinə köçür 30,32.Spaca6 homoloqları müxtəlif məməlilərdə və digər eukariotlarda mövcuddur 30 və onun insan gametlərinin birləşməsi üçün əhəmiyyəti SPACA6 30-a müqavimət göstərərək in vitro insanın mayalanmasının inhibə edilməsi ilə nümayiş etdirilmişdir.IZUMO1 və JUNO-dan fərqli olaraq, SPACA6-nın strukturu, qarşılıqlı əlaqəsi və funksiyasının təfərrüatları qeyri-müəyyən olaraq qalır.
Bizə ailə planlaması və məhsuldarlığın müalicəsində gələcək inkişafları məlumatlandırmaq imkanı verəcək insan sperma və yumurtalarının birləşməsinin əsasını təşkil edən əsas prosesi daha yaxşı başa düşmək üçün SPACA6 struktur və biokimyəvi tədqiqatlar apardıq.SPACA6-nın hüceyrədənkənar domeninin kristal quruluşu kvazi-çevik bölgələrlə əlaqəli dörd spiral dəstə (4HB) və immunoqlobulinə bənzər (Ig-bənzər) domenini göstərir.Əvvəlki tədqiqatlarda proqnozlaşdırıldığı kimi, 7,32,37 SPACA6-nın domen strukturu insan IZUMO1-in quruluşuna bənzəyir və iki zülal qeyri-adi motivi bölüşür: üçbucaqlı spiral səthi və bir cüt disulfidlə əlaqəli CXXC motivləri olan 4HB.Biz təklif edirik ki, IZUMO1 və SPACA6 indi gamet birləşməsi ilə əlaqəli daha böyük, struktur cəhətdən əlaqəli zülalların super ailəsini təyin edir.Super ailəyə xas olan xüsusiyyətlərdən istifadə edərək, AlphaFold struktur insan proteomu üçün hərtərəfli axtarış apardıq, bu super ailənin əlavə üzvlərini, o cümlədən qametlərin birləşməsində və/və ya mayalanmada iştirak edən bir neçə üzvü müəyyən etdik.İndi görünür ki, gamet birləşməsi ilə əlaqəli ümumi bir struktur qat və zülalların super ailəsi var və quruluşumuz insan gametlərinin birləşmə mexanizminin bu mühüm aspektinin molekulyar xəritəsini təqdim edir.
SPACA6, bir N ilə əlaqəli qlikan və altı ehtimal olunan disulfid bağı olan bir keçidli transmembran zülaldır (Şəkillər S1a və S2).Drosophila S2 hüceyrələrində insan SPACA6-nın (qalıqlar 27-246) hüceyrədənkənar domenini ifadə etdik və nikel yaxınlığı, kation mübadiləsi və ölçü istisna xromatoqrafiyasından istifadə edərək zülalı təmizlədik (Şəkil S1b).Təmizlənmiş SPACA6 ektodomen çox sabit və homojendir.Çoxbucaqlı işığın səpilməsi (SEC-MALS) ilə birləşdirilmiş ölçü istisna xromatoqrafiyasından istifadə edilən analiz, hesablanmış molekulyar çəkisi 26,2 ± 0,5 kDa olan bir zirvə aşkar etdi (Şəkil S1c).Bu, SPACA6 monomerik ektodomeninin ölçüsünə uyğundur və təmizlənmə zamanı oliqomerləşmənin baş vermədiyini göstərir.Bundan əlavə, dairəvi dikroizm (CD) spektroskopiyası ərimə nöqtəsi 51,3 °C olan qarışıq α/β strukturunu aşkar etdi (şəkil S1d,e).CD spektrlərinin dekonvolutioni zamanı 38,6% α-spiral və 15,8% β-zəncirli elementlər aşkar edilmişdir (Şəkil S1d).
SPACA6 ektodomen təsadüfi matris səpilməsi38 istifadə edərək kristallaşdırıldı və nəticədə 2.2 Å qətnamə ilə məlumat dəsti əldə edildi (Cədvəl 1 və Şəkil S3).Strukturun müəyyən edilməsi üçün fraqmentə əsaslanan molekulyar əvəzetmə və SAD mərhələli məlumatların bromid ifşası ilə kombinasiyasından istifadə etməklə (Cədvəl 1 və Şəkil S4), son təmizlənmiş model 27-246 qalıqlarından ibarətdir.Quruluş müəyyən edilən zaman heç bir eksperimental və ya AlphaFold strukturları mövcud deyildi.SPACA6 ektodomeninin ölçüləri 20 Å × 20 Å × 85 Å, yeddi spiral və doqquz β-teldən ibarətdir və altı disulfid bağı ilə sabitləşmiş uzunsov üçüncü qata malikdir (Şəkil 1a, b).Asn243 yan zəncirinin sonunda zəif elektron sıxlığı bu qalığın N ilə əlaqəli qlikozilləşmə olduğunu göstərir.Struktur iki domendən ibarətdir: N-terminal dörd sarmal dəstəsi (4HB) və onların arasında aralıq menteşə bölgəsi olan C-terminal Ig-ə bənzər domen (şəkil 1c).
SPACA6-nın hüceyrədənkənar domeninin strukturu.SPACA6-nın hüceyrədənkənar domeninin zolaq diaqramı, zəncirin N-dən C-terminusuna qədər tünd mavidən tünd qırmızıya qədər.Disulfid bağlarında iştirak edən sisteinlər magenta ilə vurğulanır.b SPACA6-nın hüceyrədənkənar sahəsinin topologiyası.Şəkil 1a-da olduğu kimi eyni rəng sxemindən istifadə edin.c SPACA6 hüceyrədənkənar sahə.4HB, menteşə və Ig kimi domen zolağı diaqramları müvafiq olaraq narıncı, yaşıl və mavi rəngdədir.Qatlar miqyasda çəkilmir.
SPACA6-nın 4HB sahəsinə antiparalel və paralel qarşılıqlı təsirlər arasında dəyişən (şəkil 2b) spiral spiral şəklində (Şəkil 2a) düzülmüş dörd əsas spiral (sarmal 1-4) daxildir.Kiçik əlavə birdövrəli spiral (spiral 1′) bağlamaya perpendikulyar olaraq qoyulur və 1 və 2-ci spirallarla üçbucaq əmələ gətirir. Bu üçbucaq 3 və 4-cü spiralların nisbətən sıx bağlamasının spiral-burulmuş qablaşdırmasında bir qədər deformasiyaya uğramışdır. Şəkil 2a).
4HB N-terminal zolaq diaqramı.b N-terminusda tünd göy rənglə və C-terminusunda tünd qırmızı rənglə vurğulanan dörd spiral dəstəsinin yuxarıdan görünüşü.c 4HB üçün yuxarıdan aşağıya spiral çarx diaqramı, hər bir qalıq bir hərfli amin turşusu kodu ilə etiketlənmiş dairə şəklində göstərilir;yalnız təkərin yuxarısındakı dörd amin turşusu nömrələnmişdir.Qütb olmayan qalıqlar sarı, qütb yüklənməmiş qalıqlar yaşıl, müsbət yüklü qalıqlar mavi, mənfi yüklü qalıqlar qırmızı rəngdədir.d 4HB domeninin üçbucaqlı üzləri, 4HBs narıncı və menteşələri yaşıl.Hər iki əlavə çubuqşəkilli disulfid bağlarını göstərir.
4HB əsasən alifatik və aromatik qalıqlardan ibarət daxili hidrofobik nüvədə cəmləşmişdir (Şəkil 2c).Nüvə Cys41 və Cys55 arasında bir disulfid bağı ehtiva edir ki, bu da 1 və 2-ci spiralları yuxarı qaldırılmış üçbucaqda birləşdirir (Şəkil 2d).Helix 1′-dəki CXXC motivi ilə menteşə bölgəsindəki β-saç sancağının ucunda tapılan başqa bir CXXC motivi arasında iki əlavə disulfid bağı əmələ gəldi (şəkil 2d).Naməlum funksiyası olan mühafizəkar arginin qalığı (Arg37) 1′, 1 və 2 spirallardan əmələ gələn içi boş üçbucağın içərisində yerləşir. Alifatik karbon atomları Cβ, Cγ və Cδ Arg37 hidrofobik nüvə ilə qarşılıqlı əlaqədə olur və onun guanidin qrupları dövri olaraq hərəkət edir. Thr32 onurğası və yan zəncir arasındakı qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə 1′ və 1 sarmalları arasında (Şəkil S5a, b).Tyr34, Arg37-nin həlledici ilə qarşılıqlı əlaqədə ola biləcəyi iki kiçik boşluq buraxaraq boşluğa uzanır.
Ig-bənzər β-sendviç domenləri hidrofobik nüvə vasitəsilə qarşılıqlı əlaqədə olan iki və ya daha çox zəncirli amfipatik β-vərəqlərin ümumi xüsusiyyətini paylaşan böyük bir zülal super ailəsidir. və iki qatdan ibarətdir (şək. S6a).Vərəq 1 dörd zəncirdən (D, F, H və I) ibarət β-vərəqdir, burada F, H və I telləri antiparalel düzülüş yaradır, I və D telləri isə paralel qarşılıqlı təsirə girir.Cədvəl 2 kiçik anti-paralel ikiqatlı beta vərəqdir (E və G telləri).E zəncirinin C-terminusu ilə H zəncirinin mərkəzi (Cys170-Cys226) arasında daxili disulfid rabitəsi müşahidə edildi (Şəkil S6b).Bu disulfid bağı immunoqlobulinin β-sendviç sahəsindəki disulfid bağının analoqudur40,41.
Dörd telli β-vərəq bütün uzunluğu boyunca bükülür, forma və elektrostatik cəhətdən fərqlənən asimmetrik kənarlar əmələ gətirir.İncə kənar SPACA6-da qalan qeyri-bərabər və elektrostatik cəhətdən müxtəlif səthlərlə müqayisədə seçilən düz hidrofobik mühit səthidir (Şəkil S6b,c).Hidrofobik səthi məruz qalmış onurğa karbonil/amin qruplarından və qütb yan zəncirlərindən ibarət bir halo əhatə edir (Şəkil S6c).Daha geniş kənar, hidrofobik nüvənin N-terminal hissəsini bloklayan və F zəncirinin onurğa sütununun açıq qütb qrupu ilə üç hidrogen bağı meydana gətirən qapaqlı spiral seqmentlə örtülür (Şəkil S6d).Bu kənarın C-terminal hissəsi qismən açıq hidrofobik nüvəsi olan böyük bir cib təşkil edir.Cib üç dəst cüt arginin qalıqları (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 və Arg212-Arg214) və mərkəzi histidin (His220) sayəsində müsbət yüklərlə əhatə olunmuşdur (Şəkil S6e).
Menteşə bölgəsi bir antiparalel üç zəncirli β-qatdan (A, B və C ipləri), kiçik 310 spiraldan və bir neçə uzun təsadüfi spiral seqmentdən ibarət olan spiral sahə ilə Ig-yə bənzər sahə arasında qısa bir seqmentdir.(Şəkil S7).Menteşe bölgəsindəki kovalent və elektrostatik kontaktlar şəbəkəsi 4HB və Ig kimi domen arasındakı oriyentasiyanı sabitləşdirir.Şəbəkəni üç hissəyə bölmək olar.Birinci hissəyə iki CXXC motivi (27CXXC30 və 139CXXC142) daxildir ki, onlar menteşədəki β-saç sancağı ilə 4HB-də 1′ spiral arasında bir cüt disulfid bağı təşkil edir.İkinci hissəyə Ig-bənzər sahə ilə menteşə arasında elektrostatik qarşılıqlı təsirlər daxildir.Menteşədəki Glu132, Ig ​​kimi domendə Arg233 və menteşədə Arg135 ilə duz körpüsü təşkil edir.Üçüncü hissəyə Ig kimi domen və menteşə bölgəsi arasında kovalent bağ daxildir.İki disulfid bağı (Cys124-Cys147 və Cys128-Cys153) menteşə döngəsini Gln131 və onurğa sümüyünün funksional qrupu arasında elektrostatik qarşılıqlı təsirlərlə sabitləşən bağlayıcıya bağlayır və birinci Ig-yə bənzər sahəyə daxil olmağa imkan verir.zəncir.
SPACA6 ektodomeninin strukturu və 4HB və Ig kimi domenlərin fərdi strukturları zülal verilənlər bazalarında struktur olaraq oxşar qeydləri axtarmaq üçün istifadə edilmişdir 42 .Biz yüksək Dali Z xalları, kiçik standart kənarlaşmalar və böyük LALI xalları olan uyğunluqları müəyyən etdik (sonuncu, struktur cəhətdən ekvivalent qalıqların sayıdır).Tam ektodomen axtarışından ilk 10 hit (Cədvəl S1) >842 məqbul Z-balı olsa da, təkcə 4HB və ya Ig-yə bənzər domen üçün axtarış göstərdi ki, bu hitlərin əksəriyyəti yalnız β-sendviçlərə uyğundur.bir çox zülalda olan hər yerdə olan qat.Dalidəki hər üç axtarış yalnız bir nəticə verdi: IZUMO1.
Uzun müddətdir ki, SPACA6 və IZUMO1-in struktur oxşarlıqlarını bölüşdüyü irəli sürülür7,32,37.Bu iki gametin sintezi ilə əlaqəli zülalların ektodomenləri yalnız 21% ardıcıllıq eyniliyini bölüşsə də (Şəkil S8a), SPACA6-da qorunan disulfid bağı nümunəsi və proqnozlaşdırılan C-terminal Ig kimi domen daxil olmaqla, kompleks sübutlar, ilkin cəhdlərə imkan verdi. Şablon kimi IZUMO1-dən istifadə edən A və SPACA6 siçanın homoloji modeli37.Bizim strukturumuz bu proqnozları təsdiqləyir və həqiqi oxşarlıq dərəcəsini göstərir.Əslində, SPACA6 və IZUMO137,43,44 strukturları menteşə bölgəsi ilə birləşdirilən oxşar 4HB və Ig-yə bənzər β-sendviç domenləri ilə eyni iki domenli arxitekturanı (Şəkil S8b) bölüşürlər (Şəkil S8c).
IZUMO1 və SPACA6 4HB adi spiral paketlərdən ümumi fərqlərə malikdir.Tipik 4HBs, endosomal birləşmədə iştirak edən SNARE zülal komplekslərində tapılanlar kimi 45,46, mərkəzi ox 47 ətrafında sabit əyriliyi saxlayan bərabər aralı spirallara malikdir. Bunun əksinə olaraq, həm IZUMO1, həm də SPACA6-da spiral sahələr dəyişkən əyrilik və qeyri-bərabər qablaşdırma (Şəkil S8d).Çox güman ki, 1′, 1 və 2 spiralların yaratdığı üçbucaqdan qaynaqlanan burulma IZUMO1 və SPACA6-da saxlanılır və 1′ spiralında eyni CXXC motivi ilə sabitləşir.Bununla belə, SPACA6-da tapılan əlavə disulfid bağı (yuxarıda 1 və 2-ci spiralları kovalent şəkildə birləşdirən Cys41 və Cys55) üçbucağın zirvəsində daha kəskin zirvə yaradır və SPACA6-nı IZUMO1-dən daha bükülmüş edir və daha aydın boşluq üçbucaqları ilə.Bundan əlavə, IZUMO1-də SPACA6-da bu boşluğun mərkəzində müşahidə olunan Arg37 yoxdur.Bunun əksinə olaraq, IZUMO1 alifatik və aromatik qalıqların daha tipik hidrofobik nüvəsinə malikdir.
IZUMO1 ikiqat və beş zəncirli β-vərəqdən ibarət Ig-yə bənzər domenə malikdir43.IZUMO1-dəki əlavə tel SPACA6-da bobini əvəz edir, bu ipdə magistral hidrogen bağlarını məhdudlaşdırmaq üçün F tel ilə qarşılıqlı əlaqədə olur.Maraqlı bir müqayisə nöqtəsi, iki zülalın Ig kimi domenlərinin proqnozlaşdırılan səth yüküdür.IZUMO1 səthi SPACA6 səthindən daha mənfi yüklüdür.Əlavə yük sperma membranına baxan C-terminusunun yaxınlığında yerləşir.SPACA6-da eyni bölgələr daha neytral və ya müsbət yüklü idi (Şəkil S8e).Məsələn, SPACA6-da hidrofobik səth (daha incə kənarlar) və müsbət yüklü çuxurlar (daha geniş kənarlar) IZUMO1-də mənfi yüklüdür.
IZUMO1 və SPACA6 arasında əlaqə və ikinci dərəcəli struktur elementləri yaxşı qorunub saxlansa da, Ig kimi domenlərin struktur düzülüşü göstərdi ki, iki sahə bir-birinə nisbətən ümumi oriyentasiyada fərqlənir (Şəkil S9).IZUMO1-in spiral dəstəsi β-sendviç ətrafında əyilmişdir və mərkəzi oxdan təxminən 50°-də əvvəllər təsvir edilmiş “bumeranq” şəklini yaradır.Bunun əksinə olaraq, SPACA6-da spiral şüa əks istiqamətə təxminən 10° əyilmişdir.Bu istiqamətlərdəki fərqlər çox güman ki, menteşə bölgəsindəki fərqlərlə bağlıdır.İlkin ardıcıllıq səviyyəsində IZUMO1 və SPACA6 sistein, qlisin və aspartik turşu qalıqları istisna olmaqla, menteşədə kiçik ardıcıllıq oxşarlığını bölüşür.Nəticədə, hidrogen bağları və elektrostatik şəbəkələr tamamilə fərqlidir.β-vərəqli ikinci dərəcəli struktur elementləri IZUMO1 və SPACA6 tərəfindən paylaşılır, baxmayaraq ki, IZUMO1-dəki zəncirlər daha uzundur və 310 sarmal (heliks 5) SPACA6 üçün unikaldır.Bu fərqlər iki oxşar zülal üçün fərqli domen istiqamətləri ilə nəticələnir.
Dali server axtarışımız göstərdi ki, SPACA6 və IZUMO1 bu xüsusi 4HB qatına malik olan zülal verilənlər bazasında saxlanılan yeganə eksperimental olaraq müəyyən edilmiş iki strukturdur (Cədvəl S1).Bu yaxınlarda DeepMind (Alphabet/Google) ilkin ardıcıllıqlardan zülalların 3D strukturlarını dəqiq proqnozlaşdıra bilən neyron şəbəkə əsaslı sistem olan AlphaFold-u işləyib hazırlayıb48.SPACA6 strukturunu həll etdikdən qısa müddət sonra, insan proteomunda olan bütün zülalların 98,5%-ni əhatə edən proqnozlaşdırıcı struktur modellərini təmin edən AlphaFold verilənlər bazası buraxıldı48,49.Axtarış modeli kimi həll edilmiş SPACA6 strukturumuzdan istifadə edərək, AlphaFold insan proteomunda model üçün struktur homoloji axtarış SPACA6 və IZUMO1 ilə mümkün struktur oxşarlıqları olan namizədləri müəyyən etdi.AlphaFold-un SPACA6-nın (Şəkil S10a) proqnozlaşdırılmasında inanılmaz dəqiqliyini, xüsusən həll edilmiş strukturumuzla müqayisədə 1.1 Å rms ektodomenini (Şəkil S10b) nəzərə alsaq, müəyyən edilmiş SPACA6 uyğunluqlarının dəqiq olacağına əmin ola bilərik.
Əvvəllər PSI-BLAST sperma ilə əlaqəli digər üç zülal ilə IZUMO1 klasterini axtarırdı: IZUMO2, IZUMO3 və IZUMO450.AlphaFold, bu IZUMO ailəsi zülallarının IZUMO1 (Şəkil 3a və S11) ilə eyni disulfid bağı nümunəsi ilə 4HB domeninə qatlanacağını proqnozlaşdırdı, baxmayaraq ki, onlar Ig-yə bənzər bir domendən məhrumdurlar.Güman edilir ki, IZUMO2 və IZUMO3 IZUMO1-ə bənzər birtərəfli membran zülallarıdır, IZUMO4 isə ifraz olunur.Qametlərin birləşməsində IZUMO 2, 3 və 4 zülallarının funksiyaları müəyyən edilməmişdir.IZUMO3-ün sperma inkişafı zamanı akrozom biogenezində rol oynadığı məlumdur51 və IZUMO zülalının kompleks əmələ gətirdiyi aşkar edilmişdir50.Məməlilərdə, sürünənlərdə və suda-quruda yaşayanlarda IZUMO zülallarının qorunub saxlanması onların potensial funksiyasının DCST1/2, SOF1 və FIMP kimi digər məlum gamet birləşmələri ilə əlaqəli zülalların funksiyaları ilə uyğun olduğunu göstərir.
IST super ailəsinin domen arxitekturasının diaqramı, müvafiq olaraq narıncı, yaşıl və mavi rənglərlə vurğulanmış 4HB, menteşə və Ig kimi domenlərlə.IZUMO4 qara görünən unikal C-terminal bölgəsinə malikdir.Təsdiqlənmiş və ehtimal olunan disulfid bağları müvafiq olaraq bərk və nöqtəli xətlərlə göstərilmişdir.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1Zold (TMEMAl) və DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) A paneli ilə eyni rəng diapazonunda göstərilir. Disulfid bağları bənövşəyi rəngdə göstərilir.TMEM95, IZUMO2 və IZUMO3 transmembran sarmalları göstərilmir.
IZUMO zülalından fərqli olaraq, digər SPACA zülallarının (yəni, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 və SPACA9) struktur olaraq SPACA6-dan fərqli olduğu düşünülür (Şəkil S12).Yalnız SPACA9-da 4HB var, lakin onun SPACA6 ilə eyni paralel-anti-paralel oriyentasiyaya və ya eyni disulfid bağına malik olması gözlənilmir.Yalnız SPACA1 oxşar Ig kimi domenə malikdir.AlphaFold, SPACA3, SPACA4 və SPACA5-in SPACA6-dan tamamilə fərqli bir quruluşa sahib olduğunu proqnozlaşdırır.Maraqlıdır ki, SPACA4 mayalanmada da rol oynayır, lakin SPACA6-dan daha böyük dərəcədə, bunun əvəzinə sperma və oosit zona pellucida52 arasında qarşılıqlı əlaqəni asanlaşdırır.
AlphaFold axtarışımız IZUMO1 və SPACA6 4HB, TMEM95 üçün başqa bir uyğunluq tapdı.Tək sperma spesifik transmembran zülalı olan TMEM95, erkək siçanları ablasiya edildikdə sonsuz edir 32,33.TMEM95 olmayan spermatozoidlər normal morfologiyaya, hərəkətliliyə və zona pellucidasına nüfuz etmək və yumurta membranına bağlanmaq qabiliyyətinə malik idi, lakin oosit membranı ilə birləşə bilmədi.Əvvəlki tədqiqatlar göstərdi ki, TMEM95 IZUMO133 ilə struktur oxşarlıqları paylaşır.Həqiqətən, AlphaFold modeli TMEM95-in IZUMO1 və SPACA6 ilə eyni cüt CXXC motivləri və SPACA6-da tapılan 1 və 2-ci sarmallar arasında eyni əlavə disulfid bağı olan 4HB olduğunu təsdiqlədi (Şəkil 3a və S11).TMEM95-də Ig-yə bənzər bir domen olmasa da, SPACA6 və IZUMO1 menteşə bölgələrinə bənzər bir disulfid bağı nümunəsi olan bir bölgəyə malikdir (Şəkil 3b).Bu əlyazmanın nəşri zamanı çapdan əvvəl server AlphaFold53 nəticəsini təsdiqləyən TMEM95 strukturu haqqında məlumat verdi.TMEM95 SPACA6 və IZUMO1-ə çox bənzəyir və artıq amfibiyalarda təkamül yolu ilə qorunub saxlanılır (Şəkil 4 və S13).
PSI-BLAST axtarışında bu ardıcıllıqların həyat ağacındakı mövqeyini müəyyən etmək üçün NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP və SOF1 verilənlər bazalarından istifadə edilib.Filial nöqtələri arasındakı məsafələr miqyasda göstərilmir.
SPACA6 və IZUMO1 arasındakı heyrətamiz ümumi struktur oxşarlıq onların TMEM95 və IZUMO 2, 3 və 4 zülallarını ehtiva edən konservləşdirilmiş struktur super ailənin qurucu üzvləri olduğunu göstərir.tanınmış üzvlər: IZUMO1, SPACA6 və TMEM95.Yalnız bir neçə üzv Ig-yə bənzər domenlərə malik olduğundan, IST super ailəsinin əlamətdar əlaməti bütün bu zülallar üçün ümumi olan unikal xüsusiyyətlərə malik 4HB domenidir: 1) Antiparalel/paralel növbə ilə düzülmüş spirallarla bükülmüş 4HB (Şəkil 2). . 5a), 2) dəstənin bağlama daxilində iki spiraldan və üçüncü şaquli sarmaldan ibarət üçbucaqlı üzü var (Şəkil. əsas sahə (şək. 5c). Tioredoksin kimi zülallarda tapılan CXXC motivinin funksiyası məlumdur. redoks sensoru kimi 54,55,56, IST ailə üzvlərinin motivi isə gamet birləşməsində ERp57 kimi protein disulfid izomerazaları ilə əlaqələndirilə bilər.Rollar əlaqələndirilir 57,58.
IST super ailəsinin üzvləri 4HB domeninin üç xarakterik xüsusiyyəti ilə müəyyən edilir: paralel və antiparalel oriyentasiya arasında dəyişən dörd spiral, ba-üçbucaqlı spiral dəstə üzləri və kiçik molekullar arasında əmələ gələn ca CXXC cüt motivi.) N-terminal sarmalları (narıncı) və menteşə bölgəsi β-saç tıxacı (yaşıl).
SPACA6 və IZUMO1 arasındakı oxşarlığı nəzərə alaraq, birincinin IZUMO1 və ya JUNO-ya bağlanma qabiliyyəti sınaqdan keçirildi.Biolayer interferometriyası (BLI) əvvəllər IZUMO1 və JUNO arasındakı qarşılıqlı əlaqəni ölçmək üçün istifadə edilmiş kinetik əsaslı bağlama üsuludur.JUNO analitinin yüksək konsentrasiyası olan yem kimi biotin etiketli sensorun IZUMO1 ilə inkubasiyasından sonra güclü siqnal aşkar edildi (Şəkil S14a), sensor ucuna bərkidilmiş biomaterialın qalınlığında məcburi səbəb dəyişikliyini göstərir.Oxşar siqnallar (yəni, IZUMO1 analitə qarşı yem kimi sensora qoşulmuş JUNO) (Şəkil S14b).SPACA6 sensora bağlı IZUMO1 və ya sensora bağlı JUNO-ya qarşı analit kimi istifadə edildikdə heç bir siqnal aşkarlanmadı (Şəkil S14a,b).Bu siqnalın olmaması onu göstərir ki, SPACA6-nın hüceyrədənkənar sahəsi IZUMO1 və ya JUNO-nun hüceyrədənkənar sahəsi ilə qarşılıqlı əlaqədə deyil.
BLI analizi yem zülalında sərbəst lizin qalıqlarının biotinilasiyasına əsaslandığı üçün, bu modifikasiya lizin qalıqları qarşılıqlı təsirdə iştirak edərsə, bağlanmanın qarşısını ala bilər.Bundan əlavə, sensora nisbətən bağlamanın oriyentasiyası sterik maneələr yarada bilər, buna görə də adi açılan analizlər rekombinant SPACA6, IZUMO1 və JUNO ektodominlərində də aparılmışdır.Buna baxmayaraq, SPACA6 His-tagged IZUMO1 və ya His-tagged JUNO (Şəkil S14c,d) ilə çökmədi, bu, BLI təcrübələrində müşahidə edilənə uyğun heç bir qarşılıqlı əlaqənin olmadığını göstərir.Müsbət bir nəzarət olaraq, JUNO-nun etiketli His IZUMO1 ilə qarşılıqlı əlaqəsini təsdiqlədik (Şəkillər S14e və S15).
SPACA6 və IZUMO1 arasındakı struktur oxşarlığına baxmayaraq, SPACA6-nın JUNO-nu bağlaya bilməməsi təəccüblü deyil.İnsan IZUMO1-in səthində JUNO ilə qarşılıqlı əlaqədə olan 20-dən çox qalıq var, o cümlədən üç bölgənin hər birinin qalıqları (baxmayaraq ki, onların əksəriyyəti menteşə bölgəsində yerləşir) (Şəkil S14f).Bu qalıqlardan yalnız biri SPACA6-da (Glu70) qorunur.Bir çox qalıq əvəzediciləri orijinal biokimyəvi xassələrini saxlasa da, IZUMO1-də əsas Arg160 qalığı SPACA6-da mənfi yüklü Asp148 ilə əvəz olundu;əvvəlki tədqiqatlar göstərdi ki, IZUMO1-də Arg160Glu mutasiyası demək olar ki, JUNO43-ə bağlanmanı tamamilə ləğv edir.Bundan əlavə, IZUMO1 və SPACA6 arasındakı domen oriyentasiyasındakı fərq, SPACA6-da ekvivalent bölgənin JUNO-bağlayıcı sahəsinin səthini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı (Şəkil S14g).
Qametlərin sintezi üçün SPACA6-ya məlum ehtiyaca və onun IZUMO1 ilə oxşarlığına baxmayaraq, SPACA6-nın ekvivalent JUNO bağlama funksiyası olmadığı görünür.Buna görə də, struktur məlumatlarımızı təkamül biologiyasının verdiyi əhəmiyyətin sübutu ilə birləşdirməyə çalışdıq.SPACA6 homoloqlarının ardıcıl düzülüşü məməlilərdən kənarda ümumi quruluşun qorunduğunu göstərir.Məsələn, sistein qalıqları hətta uzaqdan qohum olan amfibiyalarda da mövcuddur (Şəkil 6a).ConSurf serverindən istifadə edərək, 66 ardıcıllığın çoxlu ardıcıl düzülmə saxlama məlumatları SPACA6 səthinə uyğunlaşdırıldı.Bu tip analiz zülal təkamülü zamanı hansı qalıqların qorunduğunu göstərə və hansı səth bölgələrinin funksiyada rol oynadığını göstərə bilər.
a CLUSTAL OMEGA istifadə edərək hazırlanmış 12 müxtəlif növdən SPACA6 ektodomenlərinin ardıcıl düzülüşü.ConSurf təhlilinə əsasən, ən mühafizəkar mövqelər mavi rənglə qeyd olunub.Sistein qalıqları qırmızı rənglə vurğulanır.Domen sərhədləri və ikinci dərəcəli struktur elementləri düzülmənin yuxarı hissəsində göstərilir, burada oxlar β-telləri, dalğalar isə sarmalları göstərir.Ardıcıllıqları ehtiva edən NCBI Giriş İdentifikatorları bunlardır: insan (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapuçin meymunu (Cebus mimic, XP_017359366), at (Equcin3, XP_017359366) us orca3_23 XP_032_034) .), qoyun (Ovis aries, XP_014955560), fil (Loxodonta africana, XP_010585293), it (Canis lupus familyis, XP_025277208), siçan (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian156381, Tasmanian_01, XP16 318), Platypus, 8) , 61_89 və Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Nömrələmə insan sifarişinə əsaslanır.b SPACA6 strukturunun yuxarıda 4HB və aşağıda Ig kimi domen ilə səthi təsviri, ConSurf serverindən qorunma təxminlərinə əsaslanan rənglər.Ən yaxşı qorunmuş hissələr mavi, orta dərəcədə qorunan hissələr ağ, ən az qorunan hissələr isə sarı rəngdədir.bənövşəyi sistein.Yüksək səviyyədə qorunma nümayiş etdirən üç səth yaması daxili etiketli yamaqlar 1, 2 və 3-də göstərilmişdir. Sağ üst hissədə 4HB cizgi filmi göstərilir (eyni rəng sxemi).
SPACA6 strukturu yüksək dərəcədə qorunan üç səth bölgəsinə malikdir (Şəkil 6b).Patch 1 4HB və menteşə bölgəsini əhatə edir və iki qorunmuş CXXC disulfid körpüsü, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 menteşə şəbəkəsi (Şəkil S7) və üç konservləşdirilmiş xarici aromatik qalıq (Phe31, Tyr73, Phe137) ehtiva edir.sperma səthində bir neçə müsbət yüklü qalıqları təmsil edən Ig-yə bənzər domeninin daha geniş kənarı (Şəkil S6e).Maraqlıdır ki, bu yamaqda əvvəllər SPACA6 30 funksiyasına müdaxilə etdiyi sübut edilmiş antikor epitopu var.Bölgə 3 Ig kimi domenin menteşəsini və bir tərəfini əhatə edir;bu bölgədə qorunmuş prolinlər (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) və xaricə baxan qütb/yüklənmiş qalıqlar var.Təəccüblüdür ki, 4HB səthindəki qalıqların əksəriyyəti çox dəyişkəndir (Şəkil 6b), baxmayaraq ki, qat SPACA6 homoloqu boyunca (hidrofob paket nüvəsinin mühafizəkarlığı ilə göstərildiyi kimi) və IST superfamilyindən kənarda qorunur.
Bu, SPACA6-da ən az aşkarlana bilən ikinci dərəcəli struktur elementlərinə malik ən kiçik bölgə olsa da, bir çox menteşə bölgəsinin qalıqları (3-cü bölgə daxil olmaqla) SPACA6 homoloqları arasında yüksək dərəcədə qorunub saxlanılır ki, bu da spiral dəstənin və β-sendviçin oriyentasiyasının rol oynadığını göstərə bilər.mühafizəkar kimi.Bununla belə, SPACA6 və IZUMO1-in menteşə bölgəsindəki geniş hidrogen bağlanmasına və elektrostatik şəbəkələrə baxmayaraq, IZUMO137,43,44-ün çoxlu icazə verilən strukturlarının uyğunlaşdırılmasında daxili elastikliyin sübutunu görmək olar.Fərdi domenlərin düzülüşü yaxşı üst-üstə düşdü, lakin domenlərin bir-birinə nisbətən oriyentasiyası mərkəzi oxdan 50 ° -dən 70 ° -ə qədər dəyişdi (Şəkil S16).Məhlulda SPACA6-nın konformasiya dinamikasını başa düşmək üçün SAXS təcrübələri aparıldı (Şəkil S17a,b).SPACA6 ektodomeninin ab initio yenidən qurulması çubuq kristal quruluşuna uyğundur (Şəkil S18), baxmayaraq ki, Kratky süjeti müəyyən dərəcədə elastiklik göstərmişdir (Şəkil S17b).Bu konformasiya IZUMO1 ilə ziddiyyət təşkil edir, burada bağlanmamış zülal həm qəfəsdə, həm də məhlulda bumeranq şəklini alır43.
Çevik bölgəni xüsusi olaraq müəyyən etmək üçün SPACA6-da hidrogen-deyterium mübadiləsi kütləvi spektroskopiyası (H-DXMS) aparıldı və əvvəllər IZUMO143-də əldə edilmiş məlumatlarla müqayisə edildi (Şəkil 7a, b).SPACA6 açıq şəkildə IZUMO1-dən daha çevikdir, bunu 100.000 s mübadilədən sonra struktur boyu daha yüksək deuterium mübadiləsi sübut edir.Hər iki strukturda, menteşə bölgəsinin C-terminal hissəsi yüksək səviyyəli mübadilə göstərir ki, bu da yəqin ki, bir-birinə nisbətən 4HB və Ig kimi domenlərin məhdud fırlanmasına imkan verir.Maraqlıdır ki, 147 CDLPLDCP154 qalığından ibarət olan SPACA6 menteşəsinin C-terminal hissəsi yüksək dərəcədə qorunan 3 bölgədir (Şəkil 6b), ola bilsin ki, domenlərarası çeviklik SPACA6-nın təkamül yolu ilə qorunan xüsusiyyəti olduğunu göstərir.Çeviklik təhlilinə əsasən, CD termal ərimə məlumatları göstərdi ki, SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) ilə müqayisədə daha az sabitdir (Şəkil S1e və S19).
a SPACA6 və b IZUMO1-in H-DXMS şəkilləri.Göstərilən vaxt nöqtələrində faiz deyterium mübadiləsi müəyyən edilmişdir.Hidrogen-deyterium mübadiləsinin səviyyələri mavidən (10%) qırmızıya (90%) qədər gradient şkalasında rənglə göstərilir.Qara qutular yüksək mübadilə sahələrini təmsil edir.Kristal strukturda müşahidə olunan 4HB, menteşə və Ig-yə bənzər sahənin sərhədləri birincil ardıcıllığın yuxarısında göstərilmişdir.10 s, 1000 s və 100.000 s-də deyterium mübadiləsi səviyyələri SPACA6 və IZUMO1-in şəffaf molekulyar səthlərində üst-üstə qoyulmuş zolaq diaqramında çəkilmişdir.Deuterium mübadiləsi səviyyəsi 50% -dən aşağı olan strukturların hissələri ağ rəngdədir.50% H-DXMS mübadiləsindən yuxarı olan sahələr gradient miqyasında rənglənir.
CRISPR/Cas9 və siçan geni nokaut genetik strategiyalarının istifadəsi sperma və yumurta bağlaması və birləşmə üçün vacib olan bir neçə amilin müəyyən edilməsinə səbəb olmuşdur.IZUMO1-JUNO və CD9 strukturunun yaxşı xarakterizə edilən qarşılıqlı əlaqəsindən başqa, gamet birləşməsi ilə əlaqəli zülalların əksəriyyəti struktur və funksional olaraq sirli olaraq qalır.SPACA6-nın biofiziki və struktur xarakteristikası mayalanma zamanı yapışma/füzyon molekulyar tapmacasının başqa bir parçasıdır.
SPACA6 və İST super ailəsinin digər üzvləri məməlilərdə, eləcə də ayrı-ayrı quşlarda, sürünənlərdə və suda-quruda yaşayanlarda yüksək dərəcədə qorunub saxlanılır;əslində, SPACA6-nın hətta zebra balığında mayalanma üçün tələb olunduğu düşünülür 59. Bu paylama DCST134, DCST234, FIMP31 və SOF132 kimi digər məlum gamet sintezi ilə əlaqəli zülallara bənzəyir və bu amillərin HAP2 çatışmazlığı olduğunu göstərir (həmçinin GCS1 kimi tanınır) bir çox protistin katalitik fəaliyyətinə cavabdeh olan zülallar., bitkilər və artropodlar.Mayalanmış füzyon zülalları 60, 61. SPACA6 və IZUMO1 arasında güclü struktur oxşarlığına baxmayaraq, bu zülallardan hər hansı birini kodlayan genlərin nokautu erkək siçanlarda sonsuzluqla nəticələndi ki, bu da onların gamet birləşməsində funksiyalarının təkrarlanmadığını göstərir..Daha geniş mənada, birləşmənin yapışma mərhələsi üçün tələb olunan məlum sperma zülallarının heç biri lazımsız deyil.
SPACA6-nın (və IST super ailəsinin digər üzvlərinin) intergametik qovşaqlarda iştirak edib-etməməsi, mühüm zülalları birləşmə nöqtələrinə cəlb etmək üçün intraqametik şəbəkələr meydana gətirməsi və ya bəlkə də hətta çətin fusogenlər kimi çıxış etməsi açıq sual olaraq qalır.HEK293T hüceyrələrində ko-immunoprecipitation tədqiqatları tam uzunluqlu IZUMO1 və SPACA632 arasında qarşılıqlı əlaqəni aşkar etdi.Bununla birlikdə, rekombinant ektodomenlərimiz in vitro ilə qarşılıqlı təsir göstərmədi, bu da Noda və digərlərində görülən qarşılıqlı təsirlərin olduğunu göstərir.konstruksiyada hər ikisi silindi (mayalanma üçün lazımsız olduğu sübut edilmiş IZUMO1-in sitoplazmik quyruğuna diqqət yetirin62).Alternativ olaraq, IZUMO1 və/və ya SPACA6 in vitroda çoxalmadığımız xüsusi bağlama mühitlərini tələb edə bilər, məsələn, fizioloji cəhətdən spesifik konformasiyalar və ya digər zülalları (məlum və ya hələ kəşf edilməmiş) ehtiva edən molekulyar komplekslər.IZUMO1 ektodomeninin perivitellin məkanında spermatozoidlərin yumurtaya bağlanmasına vasitəçilik etdiyi güman edilsə də, SPACA6 ektodomeninin məqsədi aydın deyil.
SPACA6-nın strukturu zülal-zülal qarşılıqlı təsirində iştirak edə bilən bir neçə qorunmuş səthi aşkar edir.CXXC motivinə bilavasitə bitişik olan menteşə bölgəsinin qorunan hissəsində (yuxarıda 1-ci Patch təyin edilmişdir) biomolekullar arasında tez-tez hidrofobik və π-yığma qarşılıqlı təsirləri ilə əlaqəli olan bir neçə xarici aromatik qalıq var.Ig kimi domenin geniş tərəfləri (region 2) yüksək dərəcədə qorunan Arg və Onun qalıqları ilə müsbət yüklü yiv əmələ gətirir və bu bölgəyə qarşı antikorlar əvvəllər gamet birləşməsini bloklamaq üçün istifadə edilmişdir 30 .Antikor altı arginin qalığından üçünə malik olan və yüksək dərəcədə qorunan His220 olan 212RIRPAQLTHRGTFS225 xətti epitopunu tanıyır.Disfunksiyanın bu xüsusi qalıqların və ya bütün bölgənin tıxanması ilə bağlı olub-olmadığı aydın deyil.Bu boşluğun β-sendviçin C-terminalının yaxınlığında yerləşməsi oosit zülalları ilə deyil, qonşu sperma zülalları ilə cis-qarşılıqlı əlaqəni göstərir.Bundan əlavə, menteşə içərisində yüksək çevik prolinlə zəngin dolaşıqlığın (sahə 3) saxlanması zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsinin yeri ola bilər və ya daha çox ehtimal ki, iki sahə arasında elastikliyin saxlanmasını göstərir.Cins SPACA6-nın naməlum rolu üçün vacibdir.gametlərin birləşməsi.
SPACA6 hüceyrələrarası yapışma zülallarının, o cümlədən Ig kimi β-sendviçlərin xüsusiyyətlərinə malikdir.Bir çox yapışan zülallar (məsələn, kadherinlər, inteqrinlər, adhezinlər və IZUMO1) zülalları hüceyrə membranından ətraf mühit hədəflərinə qədər genişləndirən bir və ya daha çox β-sendviç domeninə malikdir63,64,65.SPACA6-nın Ig-bənzər domeni həmçinin yapışma və birləşmə β-sendviçlərində rast gəlinən motivi ehtiva edir: mexaniki sıxaclar kimi tanınan β-sendviçlərin uclarında paralel iplərin dubletləri66.Bu motivin hüceyrələrarası qarşılıqlı təsirlərdə iştirak edən zülallar üçün dəyərli olan kəsici qüvvələrə qarşı müqaviməti artırdığına inanılır.Bununla belə, adhezinlərlə bu oxşarlığa baxmayaraq, hazırda SPACA6-nın yumurta ağları ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğuna dair heç bir sübut yoxdur.SPACA6 ektodomen JUNO-ya bağlana bilmir və burada göstərildiyi kimi SPACA6-ifadə edən HEK293T hüceyrələri zona 32 olmayan oositlərlə demək olar ki, qarşılıqlı əlaqədə olmur.Əgər SPACA6 intergametik bağlar yaradırsa, bu qarşılıqlı təsirlər post-translational dəyişikliklər tələb edə bilər və ya digər sperma zülalları tərəfindən sabitləşə bilər.Sonuncu fərziyyəni dəstəkləmək üçün, IZUMO1 çatışmazlığı olan spermatozoidlər oositlərə bağlanır, IZUMO1-dən başqa molekulların gamet yapışma addımında iştirak etdiyini nümayiş etdirir 27 .
Bir çox viral, hüceyrə və inkişaf füzyon zülalları fusogenlər kimi funksiyalarını proqnozlaşdıran xüsusiyyətlərə malikdir.Məsələn, viral füzyon qlikoproteinləri (I, II və III siniflər) ev sahibi membrana daxil edilən zülalın sonunda hidrofobik birləşən peptid və ya ilgəyə malikdir.IZUMO143-ün hidrofillik xəritəsi və IST super ailəsinin strukturu (müəyyən edilmiş və proqnozlaşdırılmış) heç bir aşkar hidrofobik birləşmə peptidini göstərməmişdir.Beləliklə, əgər IST super ailəsində hər hansı zülal fusogenlər kimi fəaliyyət göstərirsə, onlar bunu digər məlum nümunələrdən fərqli şəkildə edirlər.
Nəticə olaraq, gamet birləşməsi ilə əlaqəli zülalların IST superfamilyası üzvlərinin funksiyaları cazibədar bir sirr olaraq qalır.Bizim xarakterizə olunan SPACA6 rekombinant molekulumuz və onun həll edilmiş strukturu bu paylaşılan strukturlar arasındakı əlaqələr və onların gamet birləşməsində və birləşməsində rolu haqqında məlumat verəcəkdir.
Proqnozlaşdırılan insan SPACA6 ektodomeninə (NCBI qoşulma nömrəsi NP_001303901.1; qalıqlar 27-246) uyğun gələn DNT ardıcıllığı Drosophila melanogaster S2 hüceyrələrində ekspressiya üçün kodonla optimallaşdırılıb və Gezakuronomics (Ecofinding) ardıcıllığı ilə gen fraqmenti kimi sintez edilib., BiP ifraz siqnalı və müvafiq 5′ və 3′ ucları bu genin puromisin (pMT-puro) ilə seçim üçün dəyişdirilmiş metallotionein promotoruna əsaslanan pMT ifadə vektoruna ligasiyadan asılı olmayaraq klonlaşdırılması üçün.pMT-puro vektoru 10x-His C-terminal etiketi ilə trombinin parçalanma yerini kodlaşdırır (Şəkil S2).
SPACA6 pMT-puro vektorunun D. melanogaster S2 (Gibco) hüceyrələrinə stabil transfeksiyası IZUMO1 və JUNO43 üçün istifadə olunan protokola oxşar şəkildə həyata keçirilib.S2 hüceyrələri əridilmiş və 10% (h/v) istiliklə təsirsizləşdirilmiş fetal dana serumu (Gibco) və 1X antimikotik antibiotik (Gibco) ilə əlavə edilmiş Schneider mühitində (Gibco) böyüdülmüşdür.Erkən keçid hüceyrələri (3,0 x 106 hüceyrə) 6 quyu plitələrinin (Corning) fərdi quyularında örtülmüşdür.27°C-də 24 saat inkubasiyadan sonra hüceyrələr istehsalçının protokoluna uyğun olaraq 2 mq SPACA6 pMT-puro vektorunun və Effectene transfeksiya reagentinin (Qiagen) qarışığı ilə transfeksiya edildi.Transfeksiya edilmiş hüceyrələr 72 saat inkubasiya edildi və sonra 6 mq/ml puromisinlə yığıldı.Hüceyrələr daha sonra tam Schneider mühitindən təcrid olundu və geniş miqyaslı protein istehsalı üçün serumsuz Insect-XPRESS mühitinə (Lonza) yerləşdirildi.S2 hüceyrə mədəniyyətinin 1 L partiyası 2 L havalandırılan düz dibli polipropilen Erlenmeyer kolbasında 8-10 × 106 ml-1 hüceyrəyə qədər böyüdüldü və sonra 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) son konsentrasiyası ilə sterilizasiya edildi və steril süzüldü.induksiya edilmişdir.İnduksiya edilmiş kulturalar dörd gün ərzində 27°C-də 120 rpm-də inkubasiya edilmişdir.
Tərkibində SPACA6 olan kondisioner mühit 4°C-də 5660×g-də sentrifuqalama yolu ilə təcrid olundu, ardınca 10 kDa MWCO membranı olan Centramate tangensial axın filtrasiya sistemi (Pall Corp).2 ml Ni-NTA agaroz qatranı (Qiagen) sütununa SPACA6 ehtiva edən konsentratlaşdırılmış mühit tətbiq edin.Ni-NTA qatranı 10 sütun həcmi (CV) bufer A ilə yuyuldu və sonra 50 mM yekun imidazol konsentrasiyasını vermək üçün 1 CV bufer A əlavə edildi.SPACA6 imidazol ilə əlavə edilmiş 10 ml tampon A ilə 500 mM yekun konsentrasiyaya qədər elüt edilmişdir.Məhdudiyyət sinfi trombini (Millipore Sigma) dializ üçün 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 və 150 ​​mM NaCl (bufer B) ilə mq SPACA6 üçün 1 vahiddə birbaşa dializ borusuna (MWCO 12-14 kDa) əlavə edildi.) 48 saat ərzində 4°C-də.Trombinlə parçalanmış SPACA6 daha sonra duz konsentrasiyasını azaltmaq üçün üç dəfə seyreltildi və 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ilə tarazlaşdırılmış 1 ml MonoS 5/50 GL kation mübadiləsi sütununa (Cytiva/GE) yükləndi.Kation dəyişdiricisi 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ilə yuyuldu, sonra SPACA6 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 25 CV üçün 0-dan 500 mM NaCl-ə qədər xətti qradiyenti ilə yuyuldu.İon mübadilə xromatoqrafiyasından sonra SPACA6 1 ml-ə qədər konsentrasiya edildi və B buferi ilə tarazlaşdırılmış ENrich SEC650 10 x 300 sütunundan (BioRad) izokratik olaraq elüt edildi. Xromatoqramma, hovuza və SPACA6 ehtiva edən konsentrat fraksiyalarına uyğun olaraq.Təmizliyə 16% SDS-poliakrilamid gel üzərində Coomassie ilə boyanmış elektroforez vasitəsilə nəzarət edildi.Protein konsentrasiyası Beer-Lambert qanunundan və nəzəri molyar sönmə əmsalından istifadə etməklə 280 nm-də udma yolu ilə ölçüldü.
Təmizlənmiş SPACA6 gecə ərzində 10 mM natrium fosfat, pH 7.4 və 150 ​​mM NaF-ə qarşı dializ edildi və CD spektroskopiyası ilə analizdən əvvəl 0.16 mq/mL-ə qədər seyreltildi.Dalğa uzunluğu 185-260 nm olan CD-lərin spektral skan edilməsi Jasco J-1500 spektropolarimetrində 50 nm/dəq sürətlə 25°C-də 1 mm optik yol uzunluğuna (Helma) malik kvars küvetlərdən istifadə etməklə toplanmışdır.CD spektrləri ilkin korrektə edilmiş, 10-dan çox əldə edilmiş orta hesabla alınmış və sm2/dmol dərəcəsində orta qalıq elliptikliyə (θMRE) çevrilmişdir:
burada MW Da-da hər bir nümunənin molekulyar çəkisidir;N - amin turşularının sayı;θ milliderece ilə elliptiklikdir;d sm ilə optik yolun uzunluğuna uyğundur;vahidlərdə protein konsentrasiyası.